蛋白酶酶活测定方法及原理简介.doc

蛋白酶酶活测定方法及原理Protease activity assay method and principle方法原理福林酚法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活考马斯亮蓝法考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由 465nm 变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在 595nm 下测定的吸光度值 A595，与蛋白质浓度成正比甲醛滴定法蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH 溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活DHT-酪蛋白法用 5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮 5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）以 DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成 DHT-肽，二价离子可与 DHT-蛋白与 DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀 DHT-肽。

选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活DNA-溴乙锭荧光分析法溴乙锭插入双链 DNA 的碱基对之间时，可使 DNA 的荧光增加 25倍接近饱和的溴乙锭(0.5µg/mL) 与 DNA 混合时，其荧光增加量与 DNA 的浓度呈正比在 DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在 DNA 链上的组蛋白，使 DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入 DNA 双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比通过测定 DNA 溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性X-光胶片法酶的底物明胶涂抹在 X-光胶片上，当待测酶液滴加到 X-光胶片上时，酶将 X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈酶活性的高低与透明圆圈的面积成正比测定圆圈的面积以测定蛋白酶的活性。