PCR 产物回收.doc

PCR产物回收一 实验目的 要求学生掌握PCR产物回收实验过程二 实验原理 本试剂盒采用新型硅基质膜技术，通过快速，简单的结合-洗涤-洗脱步骤可从大量普通或低熔点琼脂糖凝胶中回收纯化50bp-50kb 的DNA 片段，溶胶速度快，每个吸附柱最高可吸附30 μg 的DNA，纯化过程中有效去除引物、核苷酸、酶、矿物油、琼脂糖等杂质，获得高纯度，完整性好的DNA 片段，回收率高达90%本试剂盒回收纯化的DNA 可直接用于测序、连接和转化、酶切、标记、体外转录等分子生物学实验三 操作步骤1. 将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管（自备）中，称取重量 注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块2. 向胶块中加入3倍体积Buffer PG；当琼脂糖凝胶浓度>2%时，建议使用6倍体积Buffer PG（如凝胶重为100 mg，其体积可视为100μl，依此类推）3. 50℃孵育10分钟，其间不断温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解注意：1）在胶充分溶解后检测pH值，若pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加10-30μl 的3M醋酸钠（pH5.0）将pH值调到5-7。

   2）胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA 的能力较弱4. （可选步骤）当回收片段<500 bp或>4 kb时，应加入1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀（如凝胶为100 mg，则加入100μl异丙醇）注意：当回收片段为500bp-4kb时，加入异丙醇不会影响回收率5. 柱平衡：向已装入收集管（CollectionTube）中的吸附柱（SpinColumnDL）中加入200 μlBufferPS，12,000rpm（~13,400×g）离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中6. 将步骤3或者步骤4所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中注意：吸附柱容积为700μl，若样品体积大于700μl 可分批加入7. （可选步骤）向吸附柱中加入500μlBufferPG，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中注意：如果后续实验用于直接测序、体外转录或显微注射，推荐用此步骤以除去所有凝胶。

8. 向吸附柱中加入650μlBufferPW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中注意：如果纯化的DNA用于盐敏感的实验（例如平末端连接或直接测序），建议加入BufferPW静置2-5分钟再离心9. 12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）10. 将吸附柱放到一个新离心管（自备）中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μlBufferEB（pH8.5），室温放置2分钟12,000rpm离心2分钟，收集DNA溶液20℃保存DNA注意：1） 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围）2） 为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重复步骤103） 洗脱体积不应小于50μl，体积过少会影响回收效率4） 如果使用TE洗脱，需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。

5）回收大于10kb的DNA片段时，BufferEB应在50℃水浴中预热，适当延长吸附和洗脱时间，可增加回收效率五 注意事项1. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在BufferPW中加入无水乙醇2. 使用前请检查BufferPG是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清3. 电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果4. 切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤5. 回收率与初始 DNA 量和洗脱体积有关6. 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心自备：无水乙醇，离心管。