RNA提取及常见失败原因.docx

RNA提取及常见失败原因1. 取50~100mg的组织，加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀（Trizol先放于冰上）2. 将匀浆室温放置5 min3. 加入200卩l氯仿,剧烈震荡混匀30s,冰上静置3 min4. 12000 rpm, 4°C 离心 15 min5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中（取400 ul ）,加入等量体积的异丙醇，上 下颠倒几次混匀，室温下放置15 min此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂6. 12000 rpm, 4C 离心 15 min7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失 用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700 ul乙醇，将RNA沉淀弹起, 漂洗此时RNA是不溶解的）9. 8000 rpm,室温离心 10min10. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失11・真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉12. 沉淀用30 ul DEPC-H2O溶解如发现沉淀难溶，68 C处理10 min13. RNA检测（1）测定样品在260 nm和280 nm的吸光值按1OD=40 ug/ ml RNA计算RNA的产量。

OD260/OD280 在 1.8-2.0⑵进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，确定RNA的完整性和污染情况低得率原因：A. 样品裂解或匀浆处理不彻底B. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A280V1 ・65原因：A. 检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而 是溶于水低离子浓度和低pH条件下, A280值会较高B. 样品匀浆时加的试剂量太少C. 匀浆后样品未在室温放置5分钟D. 水相中混有有机相E. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解RNA降解A. 组织取出后没有马上处理或冷冻B. 样品或提取的RNA沉淀保存于-5—-20°C,未在-60—-70°C保存C. 细胞在胰酶处理时被破坏D. 溶液或离心管未经RNase去除处理。