液相色谱二元多阶梯线性梯度曲线的最优化.pdf
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研究报告液相色谱二元多阶梯线性梯度曲线的最优化邹汉法 张玉奎 包绵生 董礼孚 卢 佩章 （中国科学院大连化学物理研究所 中国大连色谱技 术研究开发中心）[ 提 要] 梯度冲 洗是液相色 谱中 分离复杂 混合物的有效方法 之一本文首 先提出了 进行 分离条件最优 化的指标， 在此基础上， 把 “ 移 动重叠分辨分离 度” 方法用于液相 色谱二元 冲 洗剂最 佳多阶梯线性 梯度曲 线的预测， 并用 十个游离胆汁酸混 合标准样的实际 分离 情况对该 方法在液相 色谱中 的可 用性 进行了 验证优化问题在现代分析化学中是一个经常 遇到的问题，对于分析仪器的自 动化和人工 智能的实现有着非常重要的联系[ 1 ] 在色 谱领域，也有许多人致力于研究色谱分离条 件的优化问题[ 2 - 9 ] ，其中影响较大 的有 G l a j c h [ 3 ,4 ]“ 重 叠分辨分离度法”，L a u b 和P u r n e l l [ 5 ,6 ] 的 “按 窗口图形法”这二种 方法主要用于已知样品的分离条件优化，当 然也可用于未知样品的优化对于未知样品最常用的方法是由色谱响应 函数作为响应指 标的所谓 串行优化方法[ 8 ,9 ] 。
最近我们 [ 1 0 ,1 1 ] 发 展了“ 移 动 重 叠 分 辨 分 离 图 ” 法 ， 用于进行气相色谱多阶梯线性程升温度曲线 的优化 本文试图把 “ 移动重叠分辨分离度法” 转移到液相色谱中，作适当改进后用于液相 色谱二元冲洗剂多阶梯线性梯度 曲线的优 化，并用十个游离胆汁酸标准混合样品的实 际分离情况对这一优化进行了验证优化指标及用于优化的规律对于已知样品要进行最佳二元冲洗剂多 阶梯线性梯度曲线的预测，必须预测冲洗剂 浓度的改变对保留值和色谱峰半宽度的影 响为此，首先用统计热力学的方法导出在 二元流动相中溶质随冲洗剂强组分浓度变化的关系式为[ 1 2 ] ： I n k ' = a ＋ b C b +c l n C b （ 1 ）大量的实验工作 已经证明该式可用于全浓度 范围内正相[ 1 3 ] 或反相色谱[ 1 4 ] 中容量因子的 变化其次发现在同一冲洗剂组成下色谱峰 的半宽度与保留值间存性关系，且在不 同冲洗剂配比的等度或梯度条件下，如其它 分离条件保持不变，则色谱峰半宽度和保留 值或虚拟保留值间存在 同一线性关系，即[ 1 5 ] ： W 1= a ' + b ' k ' （ 2） 这些规律使得有可能预测全浓度范围内各组 分的容量因子和半峰宽。
如以半峰宽分离度 K1 作为评价 色谱 图分离情况的指标，设样品含有s 个组分， 考虑分离要求和分析时间，则二元冲洗剂多 阶梯线性梯度曲线选择的优化指标是： 1 . 所有相邻峰的分离度无论在阶梯冲 洗剂组成还是性梯度阶段时都必须满足： K1 h >Klr e q ( h ＝1 , 2 , 3 , ⋯ ⋯ , s - 1 ) （ 3） 式中K1r e q 是所要求的半峰宽分离度指标 2 ．使最后一个组分的出峰时间尽可能 地短，从而在最短时间内完成样品的分离 众所周知， 在液相色 谱的等 度冲洗下的 半峰宽分离度可 写成：但在进行多阶梯线性梯度曲线的优化时，不仅要考虑下一阶梯冲洗剂强度对分离 度K1 的影响，还必须考虑溶质在色谱柱内已经走 过的路径对 K1 的 作用因此判断色谱图分 离情况的K1 应有以下的表达式：式中的 t 0,k ' x h ,wx l /2 ( h ) 和x ( h ) 分别是色谱柱 系统的死时间和在第x阶梯冲洗剂组成时溶 质h的容量因子，半峰宽和剩余柱长百分数 对于 s 个组分的混合样品，液相色谱柱 系统的死时间 t 0 是恒定的，k ' x h 和Wx 1 ( h ) 可 由（ 1 ） 、 （ 2 ） 式预测， x (h ) 的求得与气相色 谱中的方法[ 1 0 ] 基本一致， 但必须考虑到二者 的差别，即在气相色谱中，当柱温升温时在 柱内所有组分都同时升温；但在液相 色谱 中，当冲洗剂组成发生改变时或进行梯度冲 洗时，在柱内溶质所经受冲洗剂组成的改变 的顺序依次从分离柱末端最远一个组分到最 近一组分，其详细情况和计算机程序将另外 讨论[ 1 6 ] 。
实验仪器及试剂仪器：北京分析仪器厂的 S Y 2 0 2 0液相 色谱仪；Wa t e r s 公司的Wa t e r s 4 9 0 程序多 波长检测器，该检测器具有自动扣除梯度基 线漂移的功能；I B M- P C 计算机 色 谱柱：2 5 0 4 m m I . D . 不锈钢柱，内 填充天津试剂二厂的 Y WG - C 1 8 ( 1 0 u m)担 体； 检 测波 长 2 1 0 n m 试剂：甲醇 （ 化学纯），二次蒸馏水， 磷酸二氢钾和高氯酸 （ 都为分析纯） 样品：T UD C ,G UD C ,G C,T C, G C D C , T C D C, G D C, T D C,T L C和 G L C 十个游离胆汁酸混合标准样品结果和讨论首先用冲洗剂组成7 0 : 3 0的甲醇水其酸 度分别为p H= 6 .3 5 , 5 . 8 7 , 5 . 6 0 , 5 . 2 0 和1 .8 0的流动相，并用以考察酸度对胆汁酸保留值变 化的影响，图1 ( a ) 和 1 ( b ) 分别给出了十个 胆汁酸组分在酸度影响下保留值的变化从 图1中可以看到酸度对GUD C, GC及GL C 的保留 值影响较大，因此选定p H= 5 .6 0 作既定酸度来研究冲洗剂组成对胆汁酸保留值 的影响，并进行冲洗剂浓度的优化工作。
表 1 列出了十个胆汁酸组分在不同甲醇浓度 下的保留容量因子和色谱峰半宽度表2 列 出了各组分按保留值变化规律方程式（ 1 ） 的表 1 十 个胆汁酸组分在不同 冲洗剂强度下的 保留 值和半峰宽曲线拟合结果，式中C b 是甲醇浓度图2 是 表2 中半峰宽度与保留值作线性 回归的结 果，同时可得到（ 2 ） 式中的常数为表 2 十个 胆汁酸组分在表1 中k ' 与Cb按保留 方 程式( 1 ) 的拟合结果a ' = 7 . 9 3 , b ' = 3 .4 0 表2 和图2 中的结果 不仅证明以前工作的正确性，也使我们有可 能对十个胆汁酸混合样品在任何甲醇浓度下 的保留值和半峰宽进行预测 把回归得到的参数a ' , b ' 和各 组分的保留 方程式( 1 ) 中的参数a , b , c 以及其它色谱参数 输入I B M- P C计算机后，经过计算机运算得 到理论最佳多阶梯线性梯度 曲线如图3 所 示图4是在此梯度曲线下胆汁酸各组分在 液相色 谱柱内的运动轨迹图4 中有二点要指出的是：其一与气相色谱[ 1中的轨迹 图 相比较，各组分经受冲洗剂梯度变化的时间 由各组分在色谱柱内所处的位置而不同；其 二是最后一个流出色 谱柱 的溶质G L C与 T L C其保留时间相差甚大，事实上可用增 加梯度程升速率来缩短G L C的保留时间， 但由于在实际工作中选定波长为2 1 0 n m，程 升速率过高，会使得基线吸光度的变化太 大，导致样品检测有困难；所以在实验中冲 洗G L C 时选用的梯度速率为每分钟0 .0 6 甲醇 浓度体积分数。
图5 是十个胆汁酸混合样品在预测得到 的最佳梯度曲线下的实际色谱分离图在实 际操作过程中，考虑到梯度迟后时间的影 响，实际进样是在仪器执行梯度命令后的 3 . 2 0 分钟进行的表3列出的是各组分在实际梯度曲线下 实验测得的保留值与理论预测的保留值间的 误差情况图5中的基线很不稳定，引起这 一现象的重要原因是在2 1 0 n m 检测波长下， 检测器对甲醇、水和HP O 4 2 - 、 H2 P O 4离子 浓度的改变很灵敏，尽管Wa t e r s 4 9 0 型紫 外可见光检测器有基线扣除的功能，但由于 实验和仪器本身存在一定的误差，仍使得基 线不能重复，导致图5中实际色谱分离图的1 9 6 ．＿一 ／1.00－ 一 冬 犷叨 -“ · ” ” 一／ 3 卜公 ／望1 砚J尸、 、1加卜， Of }T一1 ！. z e, m，1 f s F t～1 1o fit0 3.0 6.0 9.0 - 12.0 F 15.0k' 了 图2表1 中 的 半 峰 宽 与 相 对 应 的 保 留 值间 的 线 性 回 归 结 果0 . 7 0 ;--Y=7 93 十 3 .4 0 X：r =0 9 9 4 0 . 6 5 ＿, ＿ ＿ 1 , 0 1 0 2 0 玄 ，( m盛 n)。
‘2 3 4气 6 7 龟 9 1 0图3理 论 预 测 的 最 佳 二 元 冲 洗 剂 多 阶 梯 线． 1.000 澎沁粼／“ 梯度 曲线 ： ”’‘“｛ 斌心 / E 0.500m滋蒸厂｛ 0.250}' 羊 ： '-0 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0t. (min)｛ ！ 图4十 个 胆 汁 酸 组 分 在 图3 所示 的 梯 度 曲 线 下 在 色 谱柱1 1 11 内 的 运 动 轨 迹＿！ ｝｝ ｝6 1 .T U D C , 2 GU D C 3 .T C . 4 _G C . 5 _T C D C 1 1 ， i l 1 7 6 GCDC, 7GDC, s_TDC, 9.TLC, lo.GLC. ｝一｛3I！！｝｝｝8 9 一 ‘ 5 -t- r Ml;tMiff 5} tRK1}Z '-I :7X, B PH IAo.6o: ｛（一叼 日 ｛（｝｛一｛ 10 0 .4 0 ＝甲 醇’ 水 ， A , B 泵 的 冲 洗剂p H值 和1 I v．！ U七 ！ 、 K H 2 P 0 4 浓 度 分 别为5 6 和 o ,o l m o l / L ， 检爪 一】一习 、 侧波 长 2 1 O n m . W - - - f ，一七 峰号同图d 。
titer表3 十 个胆汁酸 组分的实 测保留 值与理论预测 值的误差情况基线不稳定此外把图5中的分离情况与分 离条件相近的等度分离结果进行比较，分析时间缩短了将近三分之二，这充分说明优化 工作有很大的优越性 从表 3中结果可以看 到，溶 质 GU D C 和 虶 GL C的预测值与实验值误差较大，引起 这一现象的原因主要有二点：一是这二个胆 汁酸组分对酸度的变化较敏感，而酸度计的 测量误差在土 0 . 1 p H值范围内，且要真正测 定有机水溶液中的酸度是相当困难的，所以 由于冲洗剂酸度的测定误差会导致这个组分 实测保留值与理论值的较大误差；其次是实 际执行的梯度曲线与理论预测的梯度曲线有 一定差距，如梯度曲线线性程升往往会产生 滞后效应，线性梯度曲线会发生一定的偏离 等等，这些因素都使得以后几个阶梯冲洗剂 组成下流出的组分的实测保留值与预测值发 生误差 但总的来说这一优化工作是成功的参考文献[ 1 ] 卢佩章、 李浩春， 仪器 仪表 学报，4 , 2 3 7 ( 1 9 8 4 ) . [ 2 ] J .W. We y l a n d ,C . H . P . B r u i n s a n d D . A . D o o r n b o s , J . C h r o m a t o g r .S c i . ,2 2 ,3 1 ( 1 9 8 4 ) . [ 3 ] J . J . K i r k l a n d a n d J . L . G l a j c h , J . C h r o m a t o g r . , 2 5 5 , 2 7( 1 9 8 3 ) . [ 4 ] J . L . G l a j c h ,J . J . Ki r k l a n d ,K. M. S q u i r e a n dJ . M. Mi n o r , J . C h r o ma t o g r . , 1 9 9 , 5 7 ( 1 9 8 0 ) . [ 5 ] R . J . L a u b 。
