国家自然科学基金相关申请材料：原发性高血压相关基因的SNPs关联分析s(老板是：朱鼎良).doc

原发性高血压相关基因的 SNPs 关联分析一、 立论依据基因组计划（human genome project HGP）的完成及多个物种基因组的完全测序[1.2.3]，为人们系统地研究基因功能及相关遗传病提供了极大的帮助，人类基因组计划的完成还促进了单核苷酸数据库的建成，并由此兴起了一门新的学科——单碱基多态性学（SniPs，SNPology）[4]SNPs 是继限制性片段长度多态性和微卫星多态性这两种遗传标记之后，出现的“第三代 DNA 遗传标记”单核苷酸多态性是指在基因组内 DNA 中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的 DNA 序列多态性，即 SNPs 是染色体 DNA 序列的某个位点上存在的单个碱基变化，如果在较大数量的人群中发生频率超过 1%，即可认为是较古老的 SNPs，而不是新近个体的突变事件理论上，SNPs 可以分别为二等位、三等位、四等位基因，也即 DNA 序列中某一位点的碱基可以是四种单核苷酸中的任意两种、三种或全部四种然而，实际上在人类基因组中一般表现为二等位基因(biallelic)，即二态性标记，非此即彼正因为这二态性标记，在基因组筛查中往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这有利于自动化技术的应用。

SNPs 在人类基因中数量多,分布广，平均不到 1000bp 个中就存在一个 SNPs 位点，即在人类 30 亿碱基中至少有 300 万个 SNPs[5.6]可能是选择压力的原因，SNPs 在基因组中的分布是不均匀的[7]根据 SNPs 在基因中的位置可分为编码区 SNPs（coding region SNPs cSNPs） ，基因周边 SNPs(perigenic SNPs pSNPs)和基因间SNPs(intergenic SNPs iSNPs)三类不同的区域出现的频率不同，彼此可相差 100 倍[7]编码区域核苷酸多样性为其他区域的四分之一，而且其中约一半为非同义突变[8]随着基因组计划的完成，人类即进入了后基因组时代，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体基因多态性和功能的研究[9]个体基因多态性的主要形式是 SNPs，随着分子生物学,分子遗传学及生物信息学等学科的发展，使人们认识到主要是基因组 DNA 序列中的这些SNPs 变异造成了人类在身材、体形、肤色、对疾病的易感性、疾病表型和对药物治疗反应等方面的显著差异自从 1996 年[10]SNPs 被公认为“第三代 DNA 遗传标记”以来，研究 SNPs 与疾病的相关性方兴未艾。

随着分子生物技术的日新月异，遗传药理学、药物基因组学也得到了强有力的推动，个体化医学的概念也在此背景下逐步发展起来怎样基于遗传药理学的发展而发展个体化医学，已成为现实可能,并开始在临床医学中得到逐步实践疾病基因 SNPs 多态性的研究，需要考虑每一单个疾病的病理生理特点，选择合适的侯选基因，研究基因多态性与临床表现型之间可能的内在联系，进而分析基因多态性对特定基因功能的影响从疾病基因型来剖析疾病临床表现多样性，有助于从基因水平重新认识疾病的本质，使我们朝着个体化临床医学的方向迈进了坚实和关键的一步[11]原发性或遗传性高血压（essential hypertension EH）研究的主要任务是阐明血压升高的遗传机制，也就是寻找高血压相关基因对这一研究的突破不仅能使我们更好地理解高血压发生的病理生理机制，而且还能指导我们对原发性高血压进行早期诊断、预防和治疗原发性高血压是一种危害人类健康的常见病，有明显的家族聚集倾向这种复杂的多基因病是由遗传因子和环境条件共同决定的，遗传因素较环境因素更具重要意义其中，遗传因素在原发性高血压发生中的比率约占 30-50%若干微效共显性基因的累积效应导致这个复杂疾病的遗传。

迄今为止，已研究了一系列相关基因，包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统的位点，上皮钠通道的位点，儿茶酚胺/肾上腺素能的功能位点，肾激肽释放酶-激肽系统位点，α-内收蛋白的位点，脂蛋白代谢，激素受体或生长因子基因位点等，但基于单一基因所作的关联分析结果并不完全一致[12]Halushka 等在 74 个欧洲与非洲后代中研究了高血压侯选基因的 SNPs，发现了 874 个侯选 SNPs，这些 SNPs 在基因组中存在的区域较广，且在不同病人亚群中植家泊嬖诓钜臁?鉴于 RAS 系统在血压调节中的重要作用，以及 ACE I/D 基因多态性的研究成果，我们拟研究高血压基因的多态性，通过对 ACE 中 I/D 及几种血管舒缩相关基因 SNPs 多态性的分析，以定量不同基因在原发性高血压发生发展中的作用血管紧张素转换酶（ACE）基因为单拷贝基因，位于染色体 17q23，包含 26 个外显子和 25 个内含子，大约 21kb通过定量特征连锁分析，证实血管紧张素转化酶 ACE 基因位点与血压连锁[13]，在ACE 位点第 16 个内含子上有一段的缺失/插入多态性，此多态性可影响这一基因的表达，影响 ACE活性水平，ACE 基因多态性分布在不同的种族中有明显的差异[14.15]。

人类血管紧张素原基因（AGT）为一单拷贝基因，位于染色体 1q42-43，大约 13kb，由 5 个外显子和 4 个内含子组成在 AGT 基因中有一种错义突变，即外显子 2 的 704 位核苷酸发生 T→C 转换，造成第 235 位氨基酸 M（甲硫氨酸）→T（苏氨酸）的置换，简称 M235T 等位基因，研究表明[16-18]血管紧张素原基因的 M235T 等位基因与高血压的风险性增高相关然而，也有一些研究未发现AGT M235T 等位基因与高血压相关[19]ATIR 基因也为单一拷贝基因，位于染色体 3q21-25，大约 2.2kb，由 5 个外显子和 4 个内含子组成[20]有研究[21]发现该基因的 A1166C 多态性与高血压相关，但也有研究[22]表明 ATIR 此多态性位点与对中国香港人高血压病的发生未发现具有作用这三者的关系：肾素是肾脏血小球旁器分泌的一种糖蛋白，具有蛋白水解酶活性在循环血液中，肾素可以使血管紧张素原 C 端两个氨基酸之间的肽键断裂成 ATI，ATI 在 ACE 作用下生成 ATII在人类 SNPs 数据库中，有关 AGT、ACE、ATIR、RENBP、Endothelin-K198N 的 SNPS 位点很多，但为什么人们只集中在上面几个 SNPs 位点的研究，且研究结果不一致呢？由于研究对象种族不同，样本抽取方式、标准及研究方法不同，使某些研究结果不一致以及不可重复性，其中更关键的问题是缺乏高特异性、高敏感性的 SNPs 的检测方法。

SNPs 的分析方法按其研究对象主要分为两大类，即，①对未知 SNP 进行分析，即找寻未知的 SNP 或确定某一未知 SNP 与某遗传病的关系；②对已知 SNP 进行分析，即对不同人群 SNP 遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断本实验利用一种新的基因多态性检测方法进行 SNPs 的分析，即高保真 DNA 聚合酶介导的三末端硫化修饰引物延伸反应[23]，这两者联合使用时，构成了一种对 SNPs 具有高度辨认能力的纳米级复合分子“开/关”系统[24]工作原理：根据引物三末端不配对碱基降低引物延伸反应效率的原理，本方法使用具有 3′→5′外切酶活性的高保真 DNA 聚合酶与三末端硫化修饰的等位基因特异性引物进行引物延伸反应在通常反应条件下，引物三末端与待测 DNA 模板配对时，能得到引物延伸产物，即达到“开”的效应；引物三末端与待测模板不配对时，则不能得到引物延伸产物，即达到“关”的效应方法特点：该方法使用了具有三外切酶活性的高保真 DNA 聚合酶，引物三末端须采用耐核酸外切酶的修饰如硫化修饰，SNP 特异性碱基可位于三末端或近三末端该 PCR 反应的高度特异性，可用于多重 PCR 分析多个 SNP 位点。

本实验利用此方法来进行高血压相关基因 SNPs 的研究，通过关联与连锁分析，确定高血压相关基因及 SNPs 与高血压的关系本实验拟采用 DNA pooling 技术检测 SNPs[25-26]参考文献[1]Genome International sequencing consortium. Nature, 2001, 429:806-921.[2]刘万青，贺林SNP-为人类基因组描绘新的蓝图(J).遗传，1998，20（6）：38-40. [3]Nei,M Molecular evolutionary genetics (M.Columbis university Press.New York,1987,pp28-29.)[4] Zhang J and Li K: Terminal labeled primer extension: A new method for SNP analysis and expression profiling. Current Drug Disc, 2001, 9:21-23.[5]Sherry ST, Ward M , Sirotkin K. Use of Molecular variation in the NCBI dbSNPS electabase(J) Human Mut , 2000,15:68-75[6]Nikerson DA，Taylor SL， Weiss KM， et al.DNA sequence diversity in a 7.9 Kb region of the human lipoprotein lipase gene. Nature Genet 1998,19:233-240[7]Halushka MK，Fan J B, Bentley K， et al. Patterns of single-nucleotide polymorphisms in candidate genes for blood pressure homeostasis(J).Nat Genet,1999,22(3):239-247[8]Cargill M,Altshuler D,Ireland J et al.Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding region of human genes〔J〕.Nat Genet,1999,22:231-239.[9]Burley SK, Almo SC, Bonanno JB,et al.Structural genomics:beyond the human genome project.Nat Genet, Oct 1999,23(2):151-157.[10]Lima JJ, Thomason DB, Mohamed MH, et al. Impact of genetic polymorphisms of the beta2-adrenergic receptor on albuterol bronchodilator pharmacodynamics. Clin Pharmacol Ther, May 1999; 65(5): 519-25.[11]张维利，易建中。

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