普通小麦-簇毛麦2v染色体端体异附加系的选育与鉴定.pdf

-1- 普通小麦普通小麦-簇毛麦簇毛麦 2V 染色体端体异附加系的染色体端体异附加系的 选育与鉴定选育与鉴定1 李淑梅，徐川梅，周波，陈佩度 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京（210095） E-mail：pdchen@ 摘摘 要要: 簇毛麦（Haynaldia villosa）具有抗多种病害、耐旱、耐寒等优良性状，是可供小麦 改良利用的优良遗传资源本研究综合利用根尖细胞有丝分裂中期染色体 Giemsa C-分带、 花粉母细胞减数分裂中期 I 染色体构型分析、荧光原位杂交（Genomic in situ hybridization, GISH）和分子标记等技术，从普通小麦-簇毛麦 2V（2D）异代换系与含有 Ph 抑制基因的中 国春高配对材料（Pairing homoeologous inhibitor, PhI）的杂交后代中选出分别含有簇毛麦 2V 长臂和短臂的普通小麦-簇毛麦 2V 端体异附加系 将控制护颖颖脊刚毛性状的基因进一步定 位在簇毛麦 2V 染色体的短臂上同时筛选出可以追踪 2V 染色体短臂的 SSR 标记 wmc25 关键词：关键词：普通小麦; 簇毛麦; 端体异附加系; 染色体 C-分带；荧光原位杂交；SSR 簇毛麦 (Haynaldia villosa) 属于禾本科 (Gramineae) 小麦族 (Triticeae) 簇毛麦属(Haynaldia Shar.)，具有抗白粉病、抗锈病、抗梭条花叶病、抗全蚀病、分蘖力强、小穗数多、耐旱及籽粒蛋白质含量高等优良性状[1]。

簇毛麦最明显的形态特征是在护颖颖脊上簇生刚毛普通小麦-簇毛麦 2V 异附加系和 2V（2D）异代换系护颖颖脊上簇生刚毛，表明该基因位于 2V 染色体上[2]由于该性状是一个十分明显而稳定的表型性状，易于观察和用作遗传分析，所以本研究试图利用携有来自 Ae. speltoides 高配对基因的 PhI材料[3]来诱导 2V 染色体产生结构变异，并在此基础上将簇毛基因定位在特定的染色体区段 1. 材料和方法材料和方法 1.1 试验材料试验材料 小麦-簇毛麦 2V（2D）异代换系和含 PhI基因（Pairing homoeologous inhibitor gene）的中国春高配对材料 C04-13 均由南京农业大学细胞遗传所提供本实验于 2003 年春配制 2V（2D）异代换系与含有 PhI高配对基因材料的杂交，诱导 2V 染色体结构变异 1.2 试验方法试验方法 1.2.1 Giemsa C-分带分带 种子置 20℃培养箱中发芽， 待根长至 1~2cm 时剪取根尖， 在 0℃冰水中处理 22~24h 后，用卡诺氏固定液（3 份 95%乙醇：1 份冰醋酸）固定，置冰箱中保存备用2~7d 后在 45%醋酸中压片。

于花粉母细胞（PMC）减数分裂期挑取含中期 I (MI) 分裂相的花药，用卡诺氏固定液固定， 2~7d 后用醋酸洋红染色、压片，观察染色体配对构型Giemsa C-分带方法参照 Gill 和 Friebe[4]程序 1.2.2 荧光原位杂交荧光原位杂交 根尖细胞有丝分裂中期和花粉母细胞减数分裂中期 I 染色体的荧光原位杂交参照陈佩度等[5]和 Jiang 等[6]的程序，略有改动用绿色荧光素标记的簇毛麦基因组 DNA 作探针，在450~490nm 波长下，簇毛麦染色体呈绿色，小麦染色体呈红色在 Olympus 荧光显微镜下1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20030307037）和和创新团队发展计划的资助 -2- 观察、照相 1.2.3 SSR DNA的提取参照 Saghai-Maroof 等[7]报道的CTAB方法略作修改PCR 扩增在Gene Amp PCR System 2700上进行反应体系10µL:10~15 ng DNA 模板, 左、右引物各0.2µL (10 nmol·µL - 1) , 1µL 10 ×PCR buffer , 0.8µL dNTP (2.5 mmol·L - 1) ； 0.8µL MgCl2 (25 mmol·L - 1) , 0.5 U Taq 酶, 补加ddH2O至10µL 。

反应条件为94℃预变性3 min ； 94℃ 30s , X℃（按所用引物确定退火温度）45 s , 72℃ 50 s, 循环35 次；72℃延伸10 min用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染, 凝胶自动分析仪照相 2. 结果与分析结果与分析 2.1 普通小麦普通小麦-簇毛麦簇毛麦 2V 端体异附加、代换系的选育与鉴定端体异附加、代换系的选育与鉴定 2.1.1 小麦小麦-簇毛麦簇毛麦 2V 短臂端体异附加、代换系的选育与鉴定短臂端体异附加、代换系的选育与鉴定 对 DS 2V（2D）× PhI 的 F3代种子分单株进行根尖细胞（RTC）有丝分裂中期染色体C-分带，发现 6 个单株根尖细胞染色体数目为 2n=42~43，都有一条端着丝粒染色体，其带型明显不同于普通小麦中国春各染色体，而与簇毛麦 2V 染色体短臂相同，具有一条强的端带和一条强的近端带及一较弱的着丝粒带（图 1a） 推断这 6 株材料为普通小麦-簇毛麦 2V短臂单端体异代换系或附加系用绿色荧光素标记的簇毛麦基因组 DNA 作探针进行根尖细胞有丝分裂中期染色体荧光原位杂交（GISH） ，结果显示该端体来自簇毛麦（图 1b） 下一代从一株 2n=43 的单端体异附加系后代中利用 GISH 鉴定出编号为 L-909-237-24 的植株2n=44, 含有 42 条小麦染色体和 2 条簇毛麦端着丝粒染色体， 对其减数分裂中期 I （PMC MI）染色体进行 GISH 和配对分析，观察到 21 个环状二价体和一个棒状二价体，棒状二价体呈现绿色信号（图 1c） ，表明这是一个纯合的端体异附加系。

穗部性状调查时发现含有簇毛麦2V 短臂端着丝粒染色体的各单株颖脊上均有颖脊刚毛（图 1d） ，与 2V（2D）异代换系的穗部性状相同表明控制颖脊刚毛的基因位于 2V 染色体短臂上 2.1.2 小麦小麦-簇毛麦簇毛麦 2V 长臂端体异附加、代换系的选育与鉴定长臂端体异附加、代换系的选育与鉴定 对 DS 2V（2D）× PhI 的 F3代种子分单株进行根尖细胞有丝分裂中期染色体 C-分带，发现 4 个单株根尖细胞染色体数目为 2n=42~43，都有一条端着丝粒染色体，其带型与簇毛麦 2V 染色体的长臂带型相同，具有弱的着丝粒带和一条近着丝粒带、一条强端带和一条弱的近端带， 初步推断为 2VL 端体 利用簇毛麦基因组 DNA 为探针对上述 4 株端体系的根尖细胞有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交（GISH）, 端着丝粒染色体呈现黄绿色杂交信号，表明该端体来自簇毛麦（图 2a） ，由此推断这 4 株材料为普通小麦-簇毛麦 2V 长臂单端体异代换系或附加系下一代从 2n=43 的单端体异附加系后代中利用 GISH 鉴定出 L-909-86-11有两条端着丝粒染色体，根尖细胞有丝分裂中期染色体 C-分带显示，一对端体的带型与 2V 长臂带型相似（图 2b） 。

对其减数分裂中期 I（PMC MI）染色体进行 GISH和配对分析，观察到 21 个二价体加 1 个由 2 条端着丝粒染色体配成的棒状二价体，棒状二价体呈现绿色信号（图 2c） ，表明这是一个纯合的端体异附加系 这些含有簇毛麦 2V 长臂端着丝粒染色体的各单株颖脊上均无颖脊刚毛（图 2d） ，表明在 2V 染色体长臂上没有控制颖脊刚毛的基因 -3- 2.2 SSR 分析分析 本研究利用位于普通小麦第二部分同源群短臂 （2AS, 2BS, 2DS） 上的 SSR 标记wmc25[ 8]在中国春、簇毛麦、硬簇麦和一套中国春-簇毛麦二体异附加系中进行扩增分析，从图 3 中可以看出引物 wmc25 在簇毛麦、硬簇麦和中国春-簇毛麦 2V 二体异附加系中扩增出大约130bp 的特异性条带，而此条带在中国春及其它 6 个二体异附加系中均未出现进一步用该引物在簇毛麦 2V 长臂及短臂端体异代换系中进行 PCR 扩增分析， 发现 2V 短臂端体异代换系 L-909-119 和 L-910-127 总能扩增出大约 130bp 的特异性条带（图 4） ，而 2V 长臂端体异代换系 L-910-218 和 L-910-108 均不能扩增出该特异性条带， 说明引物 wmc25 的特异性扩增位点位于簇毛麦 2V 染色体的短臂上。

可以用来追踪普通小麦中的簇毛麦 2V 染色体短臂 本实验室纪剑辉[9]将位于第二部分同源群长臂上的 RFLP 探针 BCD135 转化成一个 STS标记 NAU/STSBCD135-1利用这一引物分别在中国春、簇毛麦、硬簇麦、以及一套中国春-簇毛麦二体附加系材料中进行 PCR 扩增分析，引物 NAU/STSBCD135-1 在簇毛麦、硬簇麦和中国春-簇毛麦 2V 二体附加系中可以扩增出约 400bp 左右的特异带， 而此带在中国春及其它 6 个二体附加系中均未出现 用该引物对 2V 长臂端体异附加系 L-909-241-38， L-952-1-45和 L-909-86-11 进行 PCR 扩增分析，发现 2V 长臂端体材料能扩增出该特异性带（图 5） ，说明引物 NAU/STSBCD135-1 在 2V 染色体长臂上具有特异扩增位点，可以用来追踪普通小麦中的簇毛麦 2V 长臂 3. 讨论讨论 簇毛麦（Haynaldia villosa）最明显的形态特征是在护颖颖脊上簇生刚毛该基因已经被定位于 2V 染色体上本研究在含有 Ae. speltoides 高配对基因的 PhI材料与 2V（2D）异代换系的杂种后代中，选育鉴定出涉及 2V 短臂及长臂的端体异代换系和异附加系，对穗部性状进行调查时发现所有的 2V 短臂端体异代换系和异附加系的穗子护颖颖脊上均具有刚毛，而 2V 长臂端体异代换系和异附加系的穗子护颖颖脊上均没有刚毛，所以可以将控制颖脊刚毛的基因定位于 2V 染色体的短臂上。

在簇毛麦 2V 染色体上还携有抗眼斑病等有用基因，利用 2V 短臂和长臂端体异附加系或异代换系，可以将这些基因进一步定位在特定的染色体臂上由于簇毛麦染色体在普通情况下与小麦染色体不发生交换、重组，因此可以利用2V 短臂上的簇毛作形态标记， 追踪与之共分离的其它基因， 可减少标记辅助选择的工作量 -4- 参考文献参考文献 [1] Blanco A, Simeone R, Resta P. The addition of Dasypyrum villosum (L.) Candargy Chromosomes to durum wheat (Triticum durum Desf.) [J]. Theor Appl Genet,1987, 74:328-333. [2] 陈佩度， 刘大钧. 普通小麦与簇毛麦杂种后代的细胞遗传学研究[J]. 南京农业大学学报， 1982， 12 （4） ： 1-16 [3] Gill B S, Friebe B, Endo T R. Standard karyotype and nomenclature system for description of chromosome bands and structural aberrations in wheat [J]. Genome.1991. 34:830-839 [4] Chen, P. D., H. Tsujimoto Haynaldia villosa; Ditelosomic addition lines; C。