液相色谱仪操作规程.docx

实验教学中心仪器操作规程（管理员用）液相色谱仪2014 年 6 月 4 日制定2017 年 3 月 1 日修订一、开机及配置仪器1. 检查流动相：① 量是否能满足使用，不够要注意及时添加；② 纯水和缓冲盐流动相每天更换；③ D 通道 10% 的甲醇溶液每周更换 2 次，负责冲洗色谱柱、清洗针、清 洗缓冲环、灌注注射器；④ 小瓶 10% 的甲醇溶液每周更换 2 次，负责清洗泵头密封圈，更换之 后需清洗柱塞杆（本仪器每小时自动清洗一次，可不清洗）；2. 打开主机：① 依次打开泵、自动进样器、柱温箱的开关，等待各部件电源灯和状态 灯点亮；② 正确连接色谱柱和检测器（柱 - 紫外、柱 - 荧光、柱 - 紫外 - 荧光）；③ 打开相应检测器开关（未配置的检测器可不打开），等待其电源灯点 亮；3. 配置仪器：① 打开电脑；② 打开右下角仪器控制器；③ 调用合适的仪器配置模板（ E 盘 HPLC 配置备份中选择，单紫外、单 荧光、紫外-荧光串接）；④ 关闭仪器控制器，保存；4. 打开工作软件：① 打开工作软件；② 仪器 -主页界面确认各部件都被勾选，等待连接灯点亮；二、系统平衡1.流动相管道脱气：（目的是置换管道内流动相）① 旋松排气阀（金色旋钮、逆时针约两圈）；② 仪器 -泵界面，调整 D 通道流动相比例为 100% ，勾选冲洗（忽略警 告执行），观察D通道管路内无气泡时可对其他通道进行脱气，每 次开机必须对D通道脱气；③ 依次按步骤②对欲使用的流动相通道进行脱气，不使用可不脱气，脱气完毕，旋紧排气阀；④ 设定流动相比例和流速（流速一般为1 mL/min）,勾选打开泵马达;2. 自动进样器灌注：① 仪器-进样器界面，灌注注射器（至少 3 次），观察注射器内无气泡为止，等待模块状态变为绿色 Ready 时执行下一步操作；② 清洗缓冲环；③ 清洗进样针（若在方法中设为进样前清洗或进样前后都清洗，则此处 可不清洗）；3. 柱温：① 设定温度为方法中要求的温度；② 没有特殊要求，一般设定温度为室温（冬季25°C、春秋30°C、夏季35°C）,也可以不设定；4. 紫外检测器设定（使用时设定）：① 勾选打开D灯和W灯（可根据实际使用情况选择只打开其中一个,开灯时确保流动相经过色谱柱和检测器），等待紫外检测器状态灯 点亮，预热平衡30分钟；② 参照方法要求设置波长；③ 监视基线，基线稳定后平衡结束，停止监视基线，开始准备进样；5. 荧光检测器设定（使用时设定）① 根据方法设置激发波长（EX）和发射波长（EM）；② 监视基线，基线稳定后平衡结束，停止监视基线，开始准备进样；三、创建方法（数据 创建仪器方法）1. 仪器参数：① 选择 U3000；2. 信号采集参数：① 采集时间设定（需优化，要确保样品中所有组分都出峰，避免影响后续样品的测定）；② 检测器选择（配置为单一检测器时无此步骤）；③ 诊断通道设定为泵压力；3. 流动相参数：① 流动相名称一般要输入，避免遗忘；② 压力下限设定为 5~10bar ，压力上限设定为 300~400 ；③ 加速度、减速度一般不动；4. 流速参数：① 删除平衡阶段；② 调节流速和流动相比例进行等度设定，直接输入百分数值；③ 如需进行梯度设定，则依次添加时间、流速、比例、梯度变化速率， 第一梯度和最后梯度的流速和比例应一致，以保持基线稳定；5. 自动进样器参数：① 吸取速度设为3yL/s （样品粘度大时应减小），吸取延迟设为3s；② 排出速度设为15yL/s,排出延迟设为0s；③ 排出到废液速度设为20yL/s；④ 取样高度（针尖距瓶底）设为 2mm；⑤ 进样冲洗设为前洗，冲洗体积设为 100〜200yL，冲洗速度设为15〜20yL/s；f 宀 nt—46. 进样模式：① 一般不动，不选旁路；7. 柱温箱参数：① 设定温度为方法中要求的温度；② 没有特殊要求，一般设定温度为室温（冬季25°C、春秋30°C、夏季35°C）,也可以不设定；8. 紫外检测器参数（使用时设定）：① 根据待测物质选择测定波长；② 测定波长带宽设定为4〜5nm,为采集数据时前后延展的峰宽总和；③ 参比波长一般不设置，为所需扣除的背景吸收相对应的波长；④ 参比波长带宽一般为30nm,参比波长下限需远离测定波长上限；⑤ 峰宽理论上为色谱图中最窄峰的半峰宽，设定时选中使用推荐值，调整峰宽使采集频率介于 10~15Hz 即可；9•二极管阵列检测器参数（紫外检测器绘制AtX三维图谱时设定）：① 根据待测物质选择测定波长范围；② 束宽设定为 1nm ，相当于扫描波长间隔；③ 峰宽理论上为色谱图中最窄峰的半峰宽，设定时选中使用推荐值，调整峰宽使采集频率介于 10~15Hz 即可；10. 时间表（需使用波长数目多于通道数目时使用）：① 可测定不同时间不同波长的吸光度；11. 荧光检测器参数（使用时设定）：① 根据待测物质选择激发波长和发射波长；② 选择 2D 数据；③ 选中温度设置并设定温度为40°C（高于室温15°C以上）；④ 峰宽理论上为色谱图中最窄峰的半峰宽，设定时选中使用推荐值，调整峰宽使采集频率介于 10~15Hz 即可；12•荧光检测器3D参数（使用时设定）：① 根据待测物质选择激发波长和发射波长；② 选择3D数据，并根据需要选择发射波长扫描、激发波长扫描或同步扫描；③ 选中温度设置并设定温度为40C（高于室温15°C以上）；④ 峰宽理论上为色谱图中最窄峰的半峰宽，设定时选中使用推荐值，调整峰宽使采集频率介于 10~15Hz 即可；13•保存① 保存至“ 01- 仪器方法”文件夹；② 注释为主要条件（流动相比例、时间、波长等）；③ 命名为日期+顺序号+用户名；四、创建序列（数据 创建 序列）1•仪器选择：① 选择 U3000；2•参数设置：① 设置名称格式；② 根据需要设置样品数和平行进样次数；③ 设置开始进样位置，注意要和样品所放位置一致；④ 进样量一般设为20 口 L；3. 方法调用：① 调用仪器方法；② 调用处理方法、报告模板、视图位置等；4. 生成样品表：① 保存至“ 05- 序列”文件夹；② 注释为样品参数（标样、试样、进样量等）；③ 命名为日期+顺序号+用户名；五、 运行样品表1. 设置进样列表参数：① 根据需要设置样品类型、标样级别；② 可根据需要修改样品名称；2. 运行样品表：① 点击队列面板；② 添加待运行的序列；③ 确认完成序列后是保持仪器就绪状态（不是运行智能待机或运行智能关机）；④ 点击就绪检查，检查无误后开始运行序列；六、 数据处理（数据 序列）1. 选择序列① 数据 -序列；② 选择已完成的待处理序列；2. 样品类型：① 标样选择校准标准品；② 试样选择未知；③ 溶剂或空白样选择基质；3. 标样级别：① 标样按浓度由低到高依次设定级别（新建级别）；② 保存；4.检测参数设置：① 双击中间浓度标样的色谱峰，进入数据处理界面② 校准和处理，检测，运行 Cobra 向导；③ 若溶剂峰为倒峰，勾选考虑塌陷峰；④ 自动选择积分时间、基线噪声范围、平滑宽度、最小峰面积；⑤ 通道设置为所用通道；5. 组分表参数设置：① 校准和处理，组分表，运行组分表向导，不需设置；② 生成样品表，双击窗口下方条格，选择相对值最接近的峰，5%；③ 评估类型可以选择峰面积或峰高；④ 校准品方法可以选择外标法或内标法；⑤ 校准类型选择过原点或者不过原点；⑥ 若是多组分或混合标样，可F9快捷向下填充或者点击右键向下填充;⑦ 输入标样的实际浓度和浓度单位；⑧ 可删除杂峰组分，修改组分名称，然后保存；6. 看结果：① 峰结果是某一样品各组分的含量，进行定量分析；② 校准可观察标曲的相关系数；七、打印报告（数据处理界面）1.内容：① 总览，序列详细信息；② 积分，每个样品各组分峰的结果（峰高、峰面积等）；③ 校准，标准曲线及其指标；④ 峰分析，峰的指标（峰宽、不对称度，塔板数等）；⑤ SST，⑥ 光谱结果，三维曲线扫描（DAD检测器）；⑦ 光谱库筛选，三维曲线比对结果；⑧ 总结，主要参数列表（保留时间、峰面积、峰高、样品量、峰类型）； 2.报告出具：① 定量分析，一般选择积分、校准和总结即可，其他根据需要选择；八、待机（短时不用仪器时选择）1.清洗色谱柱：① 流动相中含盐，10%甲醇清洗所用通道 30min ，100%甲醇或乙腈清洗 30min；② 流动相中不含盐， 100%甲醇或乙腈清洗所用通道 30min； 2.低流速冲洗：① 设置流动相为纯有机相；② 流速设置为 0.1 或 0.05mL/min ；③ 注意调节压力下限为 0；3. 智能待机① 序列界面选择 0-Wash 序列；② 根据流动相是否有盐选择冲洗方法（无盐方法 1 、有盐方法 2 ）；③ 将序列状态由完成改为空闲，并保存；④ 提交序列，在序列界面设置完成后运行智能待机（下次运行序列前需 改为保持仪器就绪）；九、关机1.关闭紫外灯：① 若使用紫外检测器，去掉勾选关闭 D 灯和 W 灯；2.清洗色谱柱：① 流动相中含盐，10%甲醇清洗所用通道 30min ，100%甲醇或乙腈清洗 30min；② 流动相中不含盐， 100%甲醇或乙腈清洗所用通道 30min；3. 关闭泵马达：① 等待柱温低于40°C，去掉勾选关闭马达；4. 依次断开各模块和软件的连接5. 依次关闭工作软件、电脑、仪器各模块6. 智能关机① 序列界面选择 0-Wash 序列；② 根据流动相是否有盐选择冲洗方法（无盐方法 1 、有盐方法 2 ）；③ 将序列状态由完成改为空闲，并保存；④ 提交序列，在序列界面设置完成后运行智能关机（下次运行序列前需 改为保持仪器就绪）；九、其他注意事项1.用过缓冲盐的流动相通道应及时清洗，以免结晶磨损色谱仪部件；2.样品进样前一定经过必要的前处理，以防堵塞污染色谱通道和部件；3.避免手动旋转样品盘，以免位置发生偏移，损坏进样器；4. 突然断电时，应立即关闭主机电源开关，等待来电且稳定后再开机使用；5. 进样器附近禁止放置杂物，以免影响注射器驱动；6. 更换流动相时，要确保流动相之间的互溶，必要时要使用过渡溶剂。

7. 停止冲洗或停流动相时关掉泵马达即可，不使用暂停或停泵8. 序列前的方块为智能启动，不勾选。