拟南芥的种植(共3页).doc

精选优质文档-----倾情为你奉上一、拟南芥播种    种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；    吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；    稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；    将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）    MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm的培养皿用12.5ml二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存     MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用专心---专注---专业大量元素(母液Ⅰ，20×)   mg／L      NH4NO3                      33 000      KNO3                        38 000      CaCl2·2H2O               8 800      MgSO4·7H2O               7 400      KH2PO4                       3 400      微量元素(母液Ⅱ，200×)   mg／L      KI                         166      H3BO3                        1 240      MnSO4·4H2O               4 460      ZnSO4·7H2O               1 720      Na2MoO4·2H2O                50      CuSO4·5H2O                   5      CoCl2·6H2O                   5      铁盐(母液Ⅲ，200×)     mg／L      FeSO4·7H2O              5 560      Na2-EDTA·2H2O           7 460     有机成分(母液Ⅳ，200×)   mg／L  ⅣA      肌醇                    20 000  ⅣB      烟酸                       100      盐酸吡哆醇(维生素B6)       100      盐酸硫胺素(维生素B1)       100      甘氨酸                     400    上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L    母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中 2．配制培养液     用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL3．溶化琼脂 4．调pH     用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8，因高温灭菌时pH会下降，所以灭菌前通常pH配成6.2左右)5.培养基的分装 6．高压灭菌 三、拟南芥的种植1．人工土配制    18份蛭石，6份黑土和1份珍珠岩混合均匀，分装于塑料灭菌袋内，扎好口，于98 kPa、121.3 ℃下，灭菌40 min冷却后备用    有时也用两种土，即上层用不含黑土的人工土，下层用上面所讲的土。

我估计原因可能有二：一是黑土容易生霉；二是黑土较难完全粉碎，较大的块状土不便于移栽2．PNS营养液：每升含    5ml 1M KNO3，    2ml 1M Ca(NO3)2˙4H2O，    2ml 1M MgSO4˙7H2O，    2.5ml 20mM  Fe.EDTA，    2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），    1ml  微量元素 注意：营养液用煮沸冷却后的凉开水配置PNS营养液母液配方：    ①1M    KNO3  101.1g    ②1M    Ca(NO3)2˙4H2O    236.15 g    ③1M    MgSO4˙7H2O，246.48 g    ④20mM  Fe.EDTA：          FeSO4       5.57g                  EDTA        7.45g注意先各自配成溶液，再混合⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：    磷酸二氢钾    130.4g    磷酸氢二钾    9.12g⑥微量元素    硼酸                     0.434g    硫酸锰（MnSO4 H2O）      1.7626g    CuSO4˙H2O                0.0798g    ZnSO4˙7H2O               0.172g    NaMoO4˙2H2O              0.0432g    NaCl                      0.585g    CoCl˙6H2O                0.00129g以上母液均配至1L种子春化A． 取适量种子置于标记好的1.5ml离心管中，加入1 ml 70％乙醇轻微振荡1 minB．去乙醇，加入1 ml体积分数为10％的NaClO (次氯酸钠), 消毒5~10 min；C．吸去NaClO, 用无菌水冲洗种子5次后, 加入600μl无菌水；D．用1ml移液枪将水连同种子吸起，均匀铺于MS平板，每皿60~100粒种子；E．吸去并风干培养基表面多余的水分。

F．加盖，封口，4℃冰箱放置2~3 d，春化使种子萌发同步化土壤培养从春化算起，平板上培养7~14 d，当幼苗具4片真叶时转入土壤(1株/盘)进行土培加盖保鲜膜1 d，及时浇水培养条件温度 ：20℃~22℃；湿度 ：70％左右；光照强度：100~120 µmolּm-2ּsec-1；在长日照条件下（16h光照，8h黑暗）培养不同光质处理时，各种光质相应光强分别为，蓝光（BL）：20 μmol.m-2.s-1；红光（Rc）：20 μmol.m-2.s-1；远红外光（FRc）：1.8 μmol.m-2.s-1，其余条件同前。