透射电镜样品制备方法.docx

透射电镜样品制备方法由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于 0.1um 以下 的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片常用的超薄切片厚度是 50-70nm在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用 的制备技术超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过 取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤一． 取材的基本要求 组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于 细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象此外还可能由于污 染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为 了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷 (1)动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内(争取 1 分钟内)投入 2.5%戊二醛固定液2)所取组织的体积要小，一般不超过lmm*lmm*lmm也可 将组织修成lmm*lmm*2mm大小长条形因为固定剂的渗 透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的 固定 3)机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫 伤与挤压4)操作最好在低温(0°C〜4°C )下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶5）取材部位要准确。

． 取材方法 将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用 新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组 织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中如果组织块带有较多 的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定1. 动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一 小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、 无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2〜3mm长的 小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块， 最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的 1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0〜4°C） 2-4小时或以 上固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液 中在4C冰箱保存送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室2. 体外培养细胞的取材（在冰浴上进行）培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出部分培养液，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将细胞悬液转移到离心管中，离心机4°C低速离心（2000转/分）10分钟，使细胞聚成团块，弃去上清，沿壁小心加入新鲜的固定液，保持细胞成团状态， 于4C冰箱中固定2小时以上。

固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液 中在4C冰箱保存送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室对于血液及其他细胞悬浮液，不宜直接固定，可在取材后 将其放入离心管，以 2000-4000 转/分的速度离心 10-15分钟， 待样品在离心管底部集结成团块状后，用吸管吸出上清液，再 缓缓滴入固定液稍加固定，然后用刮铲将样品取出并切割成小 块，再行固定3. 植物组织取材植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不像动物 细胞那么迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗 透，因此，植物材料的取材宜切成薄片状或牙签状，经适当的 固定后再切成小方块固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液 中在4C冰箱保存送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室4. 细菌及藻类等样品取材对于不易成团的样品，需先清洗，加入固定液后吹散，于4C冰箱中固定2小时，固定结束后，PBS清洗3次，继续按照文献《琼脂铸模法制备透射电镜样品》（白焕红）内描述方法进行琼脂预固定再将琼脂预包埋后的样品于4°C冰箱中固 定过夜固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液 中在4C冰箱保存。

送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室缓冲液配方磷酸盐缓冲液（三个步骤）1.磷酸盐缓冲液（0.2M）甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液Na2HPO42H2O35.61gNaH2PO4H2O 27.60g(Na2HPO47H2O)53.65g( NaH2PO42H2O) 31.21g(Na2HP0412H20)71.64g加蒸憎水溶解成1000ml加蒸憎水溶解成 1000ml2.按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液0.2M 磷酸盐缓冲液的配制pH6.46.66.87.07.27.47.67.88.0甲液（ml）26.537.549.061.072.081.087.091.594.7乙液（ml）73.562.551.039.028.019.013.08.55.33•将溶液用蒸憎水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。