核酸的含量测定I——紫外吸收法.docx

实验35核酸的含量测定I——紫外吸收法、目的和要求1、 学习紫外吸收法测定核酸含量的原理2、 掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法二、实验原理DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外吸收是嘌吟环 和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有嘌吟和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的性质 核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用& (P)表示 (P)为每升溶液中含有1摩尔核酸磷时的 吸光度(即光密度，或光吸度)RNA的& (P) 260nm (pH7)为7700〜7800, RNA中磷 的质量分数约为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0口 g RNA的吸光度为0.022〜0.024小牛胸腺DNA 钠盐的& (P) 260nm (pH7)为6600，含磷的质量分数为9.2%，因此每毫升溶液中含1.0口 g DNA钠盐的吸光度为0.020不同形式DNA紫外吸光度不同，因为DNA具有双螺旋结构，当过量的酸、 碱或加热使DNA变性，则出现& (P) 260nm值升高的增色效应现象在核苷酸量相同的情况 下，& (P) 260nm有以下关系：单核苷酸〉单链DNA＞双链DNADNA变性后，双螺旋 结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外吸光度增加，还可根据DNA溶液在260nm出吸光度 的变化监测DNA变性情况。

变性DNA复性后，& (P) 260nm值降低，称为减色效应蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光蛋白质的吸收峰在280nm波长处，在260nm 处的吸光度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定 影响不大RNA在260nm与280nm处的吸光度的比值在2.0以上，DNA在260nm与280nm 处的吸光度的比值为1.9左右当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降紫外吸收发测定 核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3ng/L的检测水平三、实验器材紫外分光光度计，容量瓶(50mL)，离心管，离心机四、实验材料及试剂(1) RNA或DNA样品(2) 钼酸铵一过氯酸沉淀剂(0.25%钼酸铵一2.5%过氯酸溶液)：将3.6mL70%过氯酸和 0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中五、实验步骤1、将样品配置成每毫升含5〜50佬的核酸溶液，于紫外分光光度计上测定260nm和280nm 处的吸光度，按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值：RNA的质量浓度(mg/L)= A260nm x稀释倍数0.024 x LADNA的质量浓度(mg/ L)= ——260 nm x稀释倍数0.020 x L式中：A 260nm 260nm波长处的光密度读数L 比色杯的厚度，一般为1cm或0.5cm0. 024 每毫升溶液内含1.0ggRNA的光密度值0. 020 每毫升溶液内含1.0ggDNA钠盐时的光密度2、如果待测的核酸样品中含有酸性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸 铵一过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液在260nm处的吸光度作为对照。

操 作如下：取两只小离心管，A管加入0.5mL样品和0.5mL蒸馏水,B管加入0.5mL样品和0.5mL 钼酸铵一过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴中放置30min，3000r/min离心10min，从A、B两管 中分别吸取0.4mL上清液到两个50mL容量瓶内，定容至刻度在紫外分光光度计上测定 260nm处的吸光度RNA （或DNA）的质量浓度（mg/L） = ―AA260nm x稀释倍数0.024（0.020） x L式中△ A A管稀释液在260nm波长处的吸光度减去B管稀释液在260nm波260nm长处的吸光度x 100%核酸的质量分数=待测液中测得的核酸质量雄 待测液中制品的质量（院）六、数据计算。