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RTPCRTPCR - RT-PCR 简介反转录•聚合酶链反应(reverse t ranscrip tio n-polymerase chain reac tion, RT-P CR)是将RNA的反转录(reverse transcription )和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结 合的技术首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量 和直接克隆特定基因的cDNA序列作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA 产物无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染RTPCR -原理只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Olig o (dT)或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得 目的基因或检测基因表达RTPCR -过程RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件 下进行cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。

在 一步法RT-PCR中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和PCR在一直观众顺次进 行1、反转录酶的选择KT••巩汛两髀方法1、Money鼠白血病病毒反转录酶有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱最适作用温度为37°2、AMV反转录酶有强的聚合酶活性和RNA酶H活性最适温度为42°2、合成cDNA引物的选择用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中 的一种对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可步法RT-PCR引物的选择:1•随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA 的反转录反应主要用于单一模板的RT-PCR反应JJ■ W rm如am伽帕£riz*第一毡合威诲示議H1 £两步谡》丄詳si員艮EJE.HJIHjU两步法2. Oligo dT适用于具有PolyA尾巴的RNA原核生物的RNA、真核生物的Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴由于Oligo dT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样 品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

3. 基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况RTPCR -影响因素RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度 引物退火的温度，扩增的循环数等1、 建议选择0.5-3.0 mM （相差0.5 mM）的硫酸镁作初步实验2、 对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利较高的温度有利于 减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率3、 大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到但如果目标RNA太稀少，或者只有很 少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次反向PCR反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一 反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA反向PCR -简介PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未 知的基因片段不扩增反转录PCR反转录PCR又称为逆转录PCR,,是指扩增mRNA的一种实验技术先将mRNA反转录 成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增mA曲' 、警掰蟲I guper finawH* CJIgidTiReverie iransinphaiMc dma tftt曲辭亠尹T丨 PCRTtt : RT-PCR反应原理反转录 PCR （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR） 又称为逆转 录PCR。

其原理是：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT） 或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因 或检测基因表达RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样 品分析成为可能该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、 构建 RNA 高效转录系统RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction） 即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技 术RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病 毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等反转录PCR - 一、反转录酶的选择1. Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较 弱最适作用温度为37°C2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性最适作 用温度为42Co3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在M n2存在下，允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。

4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体:商品名为SuperScrip t和SuperScrip til此种 酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转 录很困难的mRNA模板合成较长cDNAo反转录PCR -二、合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA用此种方法时，体系 中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性 通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNAo2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Po ly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故 此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核背酸作为引物, 若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3'端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增反转录PCR -三、操作步骤1•总RNA的提取2. cDNA第一链的合成(Reverse Transcription)：目前试剂公司有多种cDNA第一链 试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一现以GIBIC0L公司提供的SuperScriptTM Preamplifica tion Sys tem for Firs t Str and cDNA Synt hesis 试剂盒为例1) 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5|j g,补充适量的DEPC H20使总体积达1 1p l在管中加10》M Oligo (dT) 12-18 1p l,轻轻混匀、离心2) 70°C加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min然后加入下列试剂的混合物：10XPCR buffer 2p l25mM MgCl2 2p l10mM dNTPmix 1p l0.1M DTT 2p l轻轻混匀，离心42°C孵育2-5min3) 加入 Superscrip till》l，在 42 C 水浴中孵育 50min4) 于70C加热15min以终止反应。

5) 将管插入冰中，加入RNase H 1》l，37C孵育20min，降解残留的RNA20C 保存备用3. PCR：(1) 取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2》l上游引物(10pM) 2》l下游引物(10pM) 2》ldNTP(2mM) 4》l10XPCR buffer 5》lTaq 酶(2u/》l) 1》l(2) 加入适量的ddH20,使总体积达50》l轻轻混匀，离心3) 设定PCR程序在适当的温度参数下扩增28-32个循环为了保证实验结果的可 靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如G3PD)的特异性引物，同时扩增 内参DNA，作为对照4) 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果5) 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描反转录PCR -四、注意事项1. 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性在总RNA的提取过程中，注 意避免mRNA的断裂2. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照3. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量常用的内参有G3PD （甘油醛-3-磷酸脱 氢酶）、B -Actin（B -肌动蛋白）等。

其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PC R反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差4. PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构 以及目标DNA起始的数量有关故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单 独实验来确定5. 防止DNA的污染：（1） 采用DNA酶处理RNA样品2） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共 线性巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的 片段第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似第二对引物称为巢式引物（因为他们 在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段 短于第一次扩增巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在 错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低因此，巢式PCR的扩增非常特异巢式PCR -定义巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR）,使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片 段第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一 次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次 扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进 行引物配对并扩增的概率极低因此，巢式PCR的扩增非常特异巢式PCR -原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链 成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝 在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链因 此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都 得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了 PCR技术的应用和发展发 现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90°C以上的高 温而不失活，不。