《新一代的流行性乙型脑炎疫苗》.docx

新一代的流行性乙型脑炎疫苗新一代流行性乙型脑炎疫苗张卓光（成都生物制品研究所成都610023）摘要流行性乙型脑炎是疫苗可预防疾病，近年开发新的Vero细胞乙型脑炎疫苗是一个热点本文介绍了五种以Veto细胞为基质的乙脑疫苗，它们的研制情况及特点关键词流行性乙型脑炎Veto细胞疫苗流行性乙型脑炎病毒，简称乙脑病毒属于黄病毒科，黄病毒属，1935年在日本分离乙脑病毒颗粒为球形、有包膜，直径45nni左右，其中核心30皿⑴含有一条正链RNA编码一个多聚蛋白，它们分别裂解加工成结构蛋白C、PrM.M、E和非结构蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5E蛋白是乙脑病毒的重要抗原，含有与病毒毒力密切相关的决定性氨基酸，能诱导产生中和抗体⑵它侵犯人中枢神经系统，所致流行性乙型脑炎（简称乙脑）是一种急性传染病，以蚊为传播媒介，主要在夏秋季流行全球每年有约50,000例报告，主要分布于亚洲20世纪90年代以来，乙脑流行区域有所扩大，一些原来为非乙脑流行的国家或地区也发生乙脑流行如1990年美属塞班岛(位于西太平洋马里亚纳群岛)3,同年7-11月在印度的西北部⑷，澳大利亚最北部的托雷斯海峡(TorresStrait)的巴度(Badu)岛都首次报告发生乙脑⑸。

乙脑不仅病死率高(30%),而且后遗症严重，约50%的幸存者有神经系统的后遗症近年国内的广东、广西等地都有局部的暴发流行，现在对乙脑的防治措施主要是防蚊和接种疫苗1954年，日本学者开发出乙脑Nakayama株鼠脑灭活纯化疫苗，86年改为北京-1株⑹；70年代，中国学者开发出乙脑P3株地鼠肾细胞灭活疫苗；89年又研制出乙脑SA14-14-2株地鼠肾细胞减毒活疫苗由于发现乙脑病毒适应于Veto细胞，而Vero细胞无外源因子和易于培养被WHO推荐做为生产疫苗的细胞基质，而以Vero细胞为基质已成功开发了狂犬和脊灰疫苗，并已广泛使用因此，近年中、美、日三国学者都在以Veto细胞基质研制新一代的乙脑疫苗，虽然有乙脑的DNA疫苗(带有Pre-M+E基因)等新技术疫苗的报道⑺，但它们的应用还需要一定的时间目前进展最快的，还是以Veto细胞为基质的新一代乙脑疫苗，而且它们有希望大规模应用，现在对它们做一个介绍1、乙脑P3株Veto细胞纯化灭活疫苗北京生物制品研究所的丁志芬等，采用乙脑病毒P3株，在Veto细胞上传代适应，发现P3株在Veto细胞上传10代以后，免疫原性下降故把P3株在Veto细胞10代以内制备毒种和疫苗⑻。

转瓶技术培养Vero细胞和乙脑P3株，滴度一般在7.0LgPFU/m1以上，病毒悬液经灭活、澄清、浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、蔗糖密度梯度离心纯化，制备成冻干疫苗其CF抗原在1:16-32,相当于中国乙脑疫苗标准品（1:4）和日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准品（1:4）的4—8倍，其蛋白含量在25—29ug/ml，低于日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准（80ug/ml）;疫苗效力高于中国乙脑疫苗和日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准品[9]O用此疫苗除初免第1针有一过性发热外（体温中强反应率为12.4%），无其他不良反应免疫2针后1个月中和抗体阳转率和几何平均滴度（GMT）分别为100.0%和1：27.7:成2、乙脑SAm-14-2株Veto细胞纯化减毒活疫苗武汉生物制品研究所吕文利等，用乙脑SA14-14-2株，接种于Vero细胞，3、6天收液，超滤浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、Sepharose4FF凝胶过滤介质纯化疫苗，制成纯化Veto细胞乙型脑炎减毒活疫苗滴度达7.2LgPFU/ml，免疫原性小鼠ED50为1（TPFU,蛋白含量20ug/ml,纯毒试验、外源因子、脑内致病力、乳鼠传代返祖试验全部合格E111o3、乙脑SAm-14-2株Veto细胞纯化灭活疫苗（JE-PIV）美国WalterReed军事研究所Ashokk.Srivastava等，采用乙脑SA14-14-2株在原代狗肾细胞（PDK）传8代后的病毒，JESA14-14-2PDK-8,在Vero细胞上，经传两代后，病毒滴度就增加了1000倍，从4.0LgPFU/ml到大于7.0LgPFU/ml,更多代次未见病毒滴度增加。

以Vero细胞4代建立主种子批，5代为工作种子批，6代为疫苗Vero细胞种毒后,3、5、7、9天收毒，滴度在7.0-8.0LgPFU/ml,第7天的滴度最高病毒原液离心过滤去除细胞碎片，超滤浓缩，硫酸鱼精蛋白处理，蔗糖密度梯度离心，福尔马林灭活，Al（0H）3吸附，加硫柳汞，配制成Veto细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)o把Veto细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)与现在国际通用的日本鼠脑纯化乙脑灭活疫苗(JE-VaX),在小鼠模型做免疫原性和保护力对比，半数有效免疫剂量(ID50)JE-PIV是4ng,JE-VaX是15ngJE-PIV引起100%中和抗体阳性的最低剂量是32ng免疫小鼠后，用乙脑SA14株W1000LD50的病毒量攻毒，需要保护50%的免疫小鼠的半数有效剂量(ED50)JE-PIV是2.6ng,JE-VaX是1.5ngo保护100%免疫小鼠的JE-PIV的最低剂量是150ng疫苗的纯毒试验，用RT-PCR,分析核昔酸序列与公布的SA14-14-2株比较，只有5311核昔酸不同疫苗是胸腺嚼噬(T)，而公布的SA14-14-2株是胞嗜噬(C)此疫苗的优点是：(1)Vero细胞培养乙脑病毒，可用无血清培养基并达到较高的滴度(7.0-8.OLgPFU/ml);(2)可反复收毒，易于大规模生产；(3)无血清培养基培养乙脑病毒，增加了疫苗的安全性，并可用简易、经济的纯化方法。

在小鼠模型中，JE-PIV较JE-VaX在相同剂量下，都能保护小鼠，JE-PIV有更强的免疫原性JE-PIV安全、有效、经济，将在志愿者中进行I期临床观察'⑵4、乙脑北京-1株Vero细胞灭活纯化疫苗口本Chemo-seroTherapeuticResearch研究所的KeishinSugawara等，以乙脑北京-1株，Veto细胞为基质开发出灭活纯化疫苗细胞库：Vero细胞122代购自ATCC,126代建立主细胞库，129代建立工作细胞库然后对细胞库进行生物安全检查合格病毒库：使用无血清培养基培养北京-1株，种毒5天后收毒在第2代建立主种子批(MVB),第4代建立工作种子批(WVB),第9代建立扩大种子批(EVB)无菌试验，外源因子检测合格，核首酸序列分析各种子批都一致为了便于大规模的工业生产该疫苗，开发了一条易于放大的工艺流程采用培养罐、微载体技术培养Veto细胞，5L、50L、500L培养罐逐级放大，种毒后用无血清培养基培养病毒，第3天病毒滴度达高峰(9.0LgPFU/ml左右)，第4天E蛋白酶标抗体(E-ELISA)检测达高峰，第4天收毒去除细胞及碎片，超滤浓缩，福尔马林灭活，蔗糖密度梯度离心，柱层析，再加附加剂制成Vero细胞灭活纯化疫苗。

Veto细胞DNA含量223.0±41.39(pg/mg),ELISA检测Veto细胞的蛋白质(HCP)含量159.7±19.60(ng/mg)把Vero细胞和鼠脑乙脑灭活纯化疫苗的物理化学和免疫原特性做一比较，见表lo表1Veto细胞和鼠脑乙脑火活纯化疫田的物理化学和免疫原特性比较蔗糖密SDS聚丙烯酰胺凝蛋白质印迹免疫匚二士工免疫血疫苗电镜观察效力(病毒中度梯度胶电泳(Western双向清中和名称病毒直径和滴度Log10)离心(SDS-PAGE)blot)扩散病毒谱Vero46.7±抗原2.85[2.25]细胞0.19nm病毒都和2.87[2.31]结果相似都观察到浓缩免疫两者都观察到E抗原呈K“L46.7±在43%原性2.74[2.25】相似鼠脑6条带双带0.43nm蔗糖处没有2.33[2.31]¥曰［】:参考疫苗从表1可知，乙脑北京-1株在Vero细胞和鼠脑上制备的疫苗，物理化学特性和免疫原性相似⑹对Vero细胞和鼠脑乙脑北京-1株灭活纯化疫苗的安全和效果，进行了动物和I期临床观察在小鼠、狗、兔中一剂量的异常毒性观察，未显示有毒性；致畸性试验，结果阴性两组志愿者各30名血清乙脑抗体阴性(对乙脑北京-1株中和抗体滴度V101),分别接种Veto细胞和鼠脑乙脑北京T株灭活纯化疫苗。

两组局部药物反应，头痛和不舒服轻微，Veto细胞组反应率6.7%,鼠脑组20.0%o两组接种3针后，血清阳转率都是100%,几何抗体平均滴度(GMT)Vero细胞组是102-35,鼠脑组是10203C13]5、黄热乙脑嵌合病毒（ChimeriVax-JE）Veto细胞减毒活疫苗黄热病毒（YF）17D株，制备黄热病减毒活疫苗有60年的安全和有效的使用历史用乙脑SA14-14-2株的结构蛋白PrM和E的基因去替换黄热病毒17D株cDNA的相应位置，而核心蛋白（O、非结构蛋白基因与病毒复制有关的部分，则保留黄热病毒17D株的基因序列，构成黄热乙脑嵌合病毒（ChimericYF/JE-S）o在体外转录为RNA后，转染Vero细胞，培养后出现细胞病变或蚀斑经检定证实为感染性嵌合体病毒后，则可继续传代保存阳]黄热乙脑嵌合病毒（prM-E）在脊椎动物和蚊来源细胞上较乙脑SA14-14-2株繁殖良好，在Veto细胞培养五天，滴度达到＞8LgPFU/ml,E蛋白仍保留乙脑病毒的抗原性和生物学特性在FRhL细胞上的prM-E基因序列与乙脑SA14-14-2株一致，与乙脑强毒株SAm和Nakayama在包膜上有6个氨基酸不同（E107、E138、E176、E279、E315、E439）。

106PFU脑内注射小白鼠无神经毒性,而黄热病毒17D株在小白鼠神经毒力较黄热乙脑嵌合病毒大黄热乙脑嵌合病毒在细胞传18代，鼠脑中传6代后，与减毒和毒力有关的氨基酸位点都存在，保持不变，显示黄热乙脑嵌合病毒的基因稳定性在小鼠皮下接种＞10'PFU的黄热乙脑嵌合病毒一针，就能保护乙脑强毒株的腹腔攻毒在猴脑内接种6.6LgPFU的黄热乙脑嵌合病毒，只引起短暂的病毒血症，没有脑炎病征，引起高滴度的乙脑抗体，能抵御乙脑强毒株的脑内攻毒对攻毒30天后猴的神经组织进行病理检查，没有或仅有轻微的脑炎病理改变；用WHO规定的黄热病毒17D株的猴神经毒性试验，检测黄热乙脑嵌合病毒符合WHO规程标准5美国Acambis公司的ThomasP.Monath等，用黄热乙脑嵌合病毒，在Veto细胞上培养的3、4和5代分别作为主种子批、工作种子批和疫苗收获Veto细胞培养嵌合病毒的上清液作为疫苗原液，用核酸酶处理以消化Veto细胞的核昔酸，使用500-kDa膜，正切流微过滤和透析过滤纯化疫苗原液，加入乳糖和人血白蛋白做保护剂，制成黄热乙脑嵌合病毒Vero细胞减毒活疫苗Veto细胞DNAvO.1ng/人份（0.5ml）,Vero细胞库、嵌合病毒种子库、疫苗经检测无外源因子[18-19]o黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗对小鼠脑内无致病力，以2.0、3.0、4.0、5.OLgPFU的剂量，猴皮下接种。

所有猴都出现低病毒血症（平均滴度高峰，1.7-2.ILgPFU/ml,平均持续时间，1.8-2.3天）,6-10天开始出现中和抗体,到第30天各剂量组的中和抗体反应相似，对同源毒株中和抗体滴度较异源毒株高在第54天，用5.2LgPFU病毒量的。