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结直肠癌与微卫星不稳定（MSI ）的10个临床问题来源：北京大学肿瘤医院消化内科微卫星不稳定（MSI ）是指由于错配修复（MMR ）蛋白缺失 （dMMR）导致微卫星序列（通常由1~6个核苷酸为单位的串联重复 DNA 序列）复制错误不能被修复，当错误累积到一定程度即形成微卫 星高度不稳定（MSI-H ）目前在结直肠癌（CRC ）诊疗中已常规开展微卫星稳定性检测， 但其对 CRC 的临床指导意义部分尚存在争议以下我们将提出并回答 10个CRC与MSI的临床问题，以期能引发一些思考并提供临床参考 建议1明B些结直肠癌需要进行MSI/MMR检测?目前越来越多的证据显示，无论家族史和发病年龄，对 CRC 患者 进行林奇综合症（LS ）的筛查有助于发现更多的LS患者,而 MSI/MMR检测是筛查的重要手段；对于口期CRC预后、高危口期辅 助治疗的选择，以及IV期CRC免疫治疗均有明确的指导作用虽然微卫星状态对皿期CRC的价值尚存在争议，但氟尿嘧啶单药 辅助化疗不获益的结论对不能耐受含铂方案的患者仍有重要提示价值 因此，美国NCCN指南及美国胃肠病协会均建议对所有CRC无论年龄 及分期，都应该进行MSI/MMR检测。

2如何选择MSI/MMR的检测方法？目前检测微卫星状态的方法主要有三种，包括免疫组化（IHC）、 聚合酶链式反应（PCR）以及二代测序（NGS）2.1聚合酶链式反应（ PCR ）采用 PCR 方法比较肿瘤组织和正常组织 DNA 中重复核苷酸序列 长度是最早确立检测CRC微卫星状态的分子手段，也是MSI检测的金 标准目前最常用的Bethesda标准由2个单核苷酸重复序列（BAT- 25和BAT-26 ）和3种二核苷酸重复序列（D5S346 , D2S123和 D17S250）构成就 Bethesda 标准而言，五个位点中出现 2 个或以上的不稳定 （Pentaplex panel出现3个及以上或更大panel中存在＞30%的重复 不稳定序列）为MSI-H，存在1个位点（或更大panel中10%~30% 的重复不稳定序列）为微卫星低度不稳定（MSI-L）,而无不稳定位 点（或更大panel中v 10%重复序列）则为微卫星稳定（MSS）既往研究表明MSI-L与MSS肿瘤生物学特点没有明显的差异，所 以临床中通常将MSI-L与MSS归为一组微卫星稳定虽然PCR是“金 标准”，但由于不能提供准确的突变基因、实验周期较长等特点一定 程度上限制了其临床的使用。

2.2免疫组化（IHC）免疫组化以其简便快捷的优势成为目前最常用的检测方式，通过 使用相应抗体检测四种常见错配修复基因（ MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2 ）在细胞核内表达的情况，明确是否存在错配修复功能缺陷 存在1种或以上蛋白表达阴性即为dMMR，相当于MSI-H;否则为错 配修复蛋白完整（pMMR），相当于MSI-L/MSSIHC检测的MMR经过严格质控后可以达到与PCR检测90%〜95% 以上的一致率另约有 5%~11%的 MSI-H CRC 四个错配修复蛋白可 以完整表达，其原因包括错配修复基因一些少见的错义突变（多为 MLH1 和 MSH6 基因）虽然影响其蛋白功能，而蛋白翻译和抗原性正 常，仍能被抗体所识别， IHC 检测实为“假阳性”;此外，由于错配 修复系统的蛋白存在功能重叠（PMS2和PMS1、MSH6和MSH3）， 因此虽然蛋白表达缺失，IHC表现为dMMR，而PCR却显示MSS 免疫组化检测本身也存在主观性，且受检测抗体质量、检测过程（固 定、染色）等因素影响，导致各中心的检测准确率高低不一2.3二代测序（NGS）随着高通量测序技术在肿瘤领域的深入发展，NGS也开始应用于 MSI 检测。

对于 CRC 而言，同时进行 MSI 和 RAS、RAF 等靶向基因 检测可以减少组织样本需求量此外，检测肿瘤突变负荷（ TMB）、 胚系基因，并发现 PCR 不能测出的体细胞杂合性缺失突变以及其他基 因结构突变导致dMMR，也是NGS的优势目前基于NGS检测MSI状态主要有两种方式，其一是通过全外显 子测序检测TMB估测MSI状态，TMB高与MSI-H显著相关另一种 方式是通过选择一组位点的 reads 数目分布直接评估微卫星不稳定的 程度（MSIsensor、mSINGS ）上述方法都证实了其对 MSI 状态评估的准确性，甚至部分方法经 过了免疫治疗临床试验的验证来自浙江大学一项研究业已证实，相 较于传统 PCR 检测，NGS-MSI ( MSI-Co Ion Core )—致性高达 99% 但目前NGS检测MSI尚缺乏统一的标准，对检测平台的仪器、技术和 生信分析能力有着更高的要求，昂贵的测序费用也是临床医生必须考 虑的问题因此，三种检测方法从临床需求来说，我们通常首选IHC或PCR 检测；如果某些患者IHC或PCR检测提示为pMMR/MSS，但具有发 病年龄早(<50岁)、强烈的肿瘤家族史、右半黏液腺/印戒细胞癌、 对常规化疗原发耐药等特殊情况，可考虑行NGS复核其微卫星状态避 免漏诊。

3同一肿瘤存在MSI/MMR的异质性吗?虽然MSI被认为是CRC发生的早期事件，异质性小，但MSI作 为免疫治疗疗效的预测指标，对帕博丽珠单抗和纳武利尤单抗的客观 缓解率(ORR )通常小于50% ( 28%~52% )，反映了该类肿瘤确实 存在异质性可能目前已有CRC中原发灶肿瘤内MSI异质性的个案报 道，但似乎对免疫治疗没有明显影响，该结论可能还需大样本研究进 一步证实原发灶和转移灶 MSI 的异质性数据也比较有限，大部分小样本研 究均发现在肝、肺、远处淋巴结的转移灶与原发灶一致率较高 （92%~100%），而腹膜及卵巢与原发灶一致率较低（分别为 75%~78%、0%）但另一项分析 40 例肠癌肝转移标本的回顾性研 究中，原发灶与肝转移灶一致率为85% （ 34/40 ）2018年ASCO公 布的一项纳入331例CRC患者的研究显示，23例dMMR原发灶患者 中26.1%转移灶检出pMMR，而308例pMMR原发灶中3.6%转移 灶检出dMMR，该研究认为CRC原发灶与转移灶MMR状态存在差 异总体来说，原发灶瘤内和原发灶与转移灶的 MSI 一致性比较高， 通常对一处进行微卫星状态评估即可。

但对于术后较长时间后才复发 转移或经过多线多疗程治疗后的患者，如果情况允许，也可考虑再次 活检评估微卫星状态4液体活检可以在MSI/MMR检测中运用吗？通过 NGS 检测外周血循环肿瘤 DNA （ ctDNA ）的 MSI（MSI from blood ， bMSI ）已逐渐崭露头角，这为晚期肿瘤患者标本取材 困难或不足提供了新的解决办法在一项大样本（n = 1145，近800例为CRC ）对比循环DNA与组 织DNA检测MSI的研究中，相较于组织MSI，bMSI达到98.4%的 —致率和95%的准确率另一项2019年在ASCO-GI公布的研究采用 bMSISEA方法（NGS ）通过ctDNA检测了 87例CRC样本（43例MSI-H和44例MSS ），当血浆ctDNA含量＞0.4%时，检测灵敏度可 达 94.1%，准确性达 97.7%；当血浆 ctDNA 含量＞1%时，准确性可 达到 100%此外，由北京大学肿瘤医院消化内科沈琳教授牵头的 bMSI 在以消化系统肿瘤为主的多中心临床疗效验证队列研究 （IMPACT 研究）业已进入数据分析阶段，结果值得期待因此，对 于肿瘤负荷大，ctDNA含量较高，而组织标本取材困难时，液体活检 检测可考虑作为一种替代方法。

5高危口期MSI-H/dMMR结直肠癌是否应该行辅助化疗？口期CRC中，MSI-H/dMMR发生率约15%，是明确的独立良好 预后指标；氟尿嘧啶单药在口期MSI-H/dMMR CRC辅助化疗不能获 益无高危因素的口期MSI-H/dMMR CRC建议观察，但对于高危口 期CRC辅助化疗，MSI-H/dMMR预测作用仍存在争议一项结肠癌大样本MSI-H/dMMR研究（n=433 ）亚组分析显示， 在高危口期的MSI-H/dMMR患者（n = 149 ）中，氟尿嘧啶联合奥沙 利铂相较于单纯手术治疗有提高无疾病生存（DFS ）的趋势 （HR=0.13 , P=0.06 ），而氟尿嘧啶与单纯手术治疗比较无显著DFS 差异（HR=0.85 , P=0.83 ）另一项基于公共数据库的口期结肠癌 （n=3851 ）回顾性分析同样证实在具有高危因素的MSI-H/dMMR患 者（n = 1906 ）中，无论单药（HR 0.38 , P=0.006 ）或联合化疗（HR 0.58 , P=0.02 ），均能延长总生存（OS）时间但也有研究认为即使 在复发风险最高的pT4组中，MSI-H/dMMR患者单纯手术、单药及 联合化疗对预后无显著性差异（P=0.691 ）。

鉴于口期MSI- H/dMMR 辅助治疗的数据多来自于回顾性研究的亚组分析，且样本量 有限，仍需要前瞻性研究进一步证实目前NCCN指南建议高危口期MSI-H/dMMR单纯观察，而CSC O指南建议行联合化疗总的来说，在免疫辅助治疗时代来临前，根据现有证据我们强烈 推荐对高危口期MSI-H/dMMR患者进行个体化的治疗决策对于老 年、体质偏弱或担心化疗相关不良反应的患者，可以选择定期观察随 访；而对于包含多个高危因素、相对年轻且治疗积极的患者，在充分 沟通获益和风险后，我们倾向可以考虑行3个月联合方案辅助化疗6 MSI/MMR状态对皿期结直肠癌有预后及治疗指导作用吗？皿期CRC中，MSI-H/dMMR约占10%，这一分期患者微卫星状 态的预后及预测作用均存在争议部分研究认为皿期 MSI-H/dMMR 仍是预后良好的因素，也有数据显示MMR状态在皿期结肠癌中与预 后无关结合 CRC 的异质性，单一的标志物较难准确判断预后近年 来提出的以n~m期结肠癌为基础的结直肠癌共识分子分型（cms） 评分，其中MSI-H、BRAF突变等被归类于CMS1型（免疫型），该 型在皿期CRC中预后较其他亚型更好。

但MSI和BRAF对于皿期CRC 与预后所占权重仍无定论，就目前的证据来说，在接受FOLFOX方案 辅助化疗的患者中，MSS/BRAF突变型预后最差，MSI-H/BRAF野生 型预后相对更好，而 MSI-H/BRAF 突变和 MSS/BRAF 野生型预后居 中此外，KRAS和左右半因素也应纳入协助判断同时，2019年 ESM O报道的一项研究显示术后ctDNA监测可以识别皿期肠癌高复发 人群，综合多个因素的预测模型或许是未来预后、预测疗效探索方向就其预测作用而言，大部分研究支持氟尿嘧啶单药对 MSI- H/dMMR结肠癌辅助治疗不获益的结论同样适用于皿期患者而奥沙 利铂在错配修复蛋白缺失情况下不影响其与DNA形成的螯合物发挥抗 肿瘤作用目前几项大型辅助治疗研究的汇总分析均显示在接受奥沙 利铂为基础的联合方案辅助化疗的皿期CRC中，MSI-H/dMMR仍是 一个预后良好的因素，且结合MSI-H/dMMR皿期患者3年内仍有近 30%~50%复发的可能性，因此目前仍建议这部分患者行术后标准的 联合辅助化疗辅助免疫治疗尚缺乏研究证据，目前正在进行的一项皿期随机对 照研究（NCT02912559 ），拟入组700例皿期MSI-H/dMMR结肠 癌患者，试验组接受 6 个月 FOLFOX 联合 atezolizumab 后使用 atezolizumab 维持 6 个月，以 DFS 作为主要终点，该项研究预计在 2020年12月完成。

对于局部分期非常晚的MSI-H/dMMR CRC患者 （尤其是ctDNA阳性）是否是辅助免疫治疗最能获益的人群，我们期 待研究结果。