设计性实验-多糖的定性与定量.pdf

设计性实验 -多糖的定性与定量 第一部分 多糖的鉴定，纯化与含量测定-----蒽酮比色法一、目的：掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法二、原理：糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色该物质在620 nm处有最大吸收，在 150 μg/ml 范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30 μg 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适三、仪器、试剂和材料1. 仪器：电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等2. 试剂：(1) 葡萄糖标准液： l00 μg/ml (2) 浓硫酸(3) 蒽酮试剂： 0.2 g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4中当日配制使用四、操作步骤1. 葡萄糖标准曲线的制作取 7 支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：管号1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖标准液（ ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸馏水（ ml）1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 葡萄糖含量（μ g）0 10 20 30 40 60 80 在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中， 管口加盖，以防蒸发。

自水浴重新煮沸起， 准确煮沸 l0 min取出，用冰浴冷却至室温，在620 nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值以标准葡萄糖含量 （μg） 为横坐标， 以吸光值为纵坐标， 作出标准曲线2. 纯化2.1.1 Savage法将多糖粗品稀释成 1.5%的水溶液 400mL ，加人 100 mL 氯仿/ 丁醇混 合液( 体积比 4，1)，充分振荡使蛋白质析出，以2 000 r/min离心30 min ，除去沉淀，将上清液再用此方法处理，重复7次. 最后得到脱去蛋白的上清液. 将该上 清液逆向流水透析 3d，将其减压浓缩至 200 mL左右，加人 2倍体积无水乙醇，充 分搅拌，放置过夜，使普鲁兰多糖沉淀，沉淀液以4 500 r/min离心30 min ，将 沉淀用丙酮、乙醚依次洗涤，P205干燥 2.1.2 DEAE一纤维素柱层析将经 Savage法除蛋白的多糖粉末溶于 10m L蒸馏水 中，进行 DEAE 一纤维素 ( 硼酸型 ) 柱层析 (3.3 cm X 40 cm)，洗脱速度为 1 mL/min. 首先用蒸馏水洗脱，分部收集( 每管5 mL)，用改良的苯酚一硫酸法比色鉴定多糖 部分，收集多糖峰，减压浓缩、透析、冷冻干燥得4.2g 样品1. 该层析柱用 0.12 m ol/L 硼砂洗脱，洗脱曲线如图 2所示. 同样收集多糖峰，浓缩、透析、冷冻干燥得 1.5 g 样品 2.1.3 SephadexG -100柱层析分别取样品进行 SephadexG -100柱层析 (1C MX 100c m),进样量为 0.5 m L ，样品质量分数为 0.70 o ，用蒸馏水进行洗脱，洗脱速度 为4 mL/h，用改良的苯酚一硫酸法比色鉴定多糖部分，各有一个洗脱峰，收集洗 脱峰后分别冷冻干燥得白色粉末3. 判别参照步骤 1，用显色反应判断样品是否为多糖。

4. 测定吸取 1 ml 已稀释的提取液于试管中，加入4.O ml 蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水取代提取液以下操作同标准曲线制作根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（μg）五、结果处理 C × V总× D 样品含糖量（ % ）= ─────────────× 100 W × V测× 106其中： C——在标准曲线上查出的糖含量（μg）， V总——提取液总体积（ ml）， V测——测定时取用体积（ ml）， D——稀释倍数， W ——样品重量（ g）， 106——样品重量单位由g 换算成 μ g 的倍数六、注意事项 ：该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类， 包括淀粉、 纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖 水解成单糖而发生反应） ，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下， 用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时， 则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则 会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。

此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比 例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差第二部分 多糖组分的检测 -----TLC分析法 1 材料与方法 1．1 药品与材料 多糖； D．葡萄糖、 D．半乳糖， D ．木糖、 L．鼠李糖、 D ．果糖上海试剂二厂； 盐酸、乙酸乙脂、口 } 匕啶、无水乙醇、正丁醇、丙酮、正丁醇、异丙醇、醋酸、 磷酸、硫酸、苯胺、二苯胺皆为分析纯试剂；实验用水为蒸馏水 微量定量点样毛细管美国科尔帕默公司；20cm ×20cm 硅胶层析板德国默克公司 1．2 单糖和混合单糖标准溶液的配置 分别称取果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖，分别溶于蒸馏水中制得五种单 糖标准液浓度均为 1．00m/m1 分别称取葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、鼠李糖，共溶于2m1 蒸馏水制得混合单 糖标准液各单糖在混合单糖标准液中的浓度为O ．50mg/ml 1．3 水解多糖样品的制备 多糖样品液加入 12mol／L的HCI O．25ml，置于高压釜中在 120～126℃条件下水 解4h。

中和、透析后稀释至 10ml 1．4 展开系统配置 展开系统 1：分别把乙酸乙脂、吡啶、无水乙醇、水按8：1：1：2(体积比 ) 的比 例混合摇匀 展开系统 2：分别把正丁醇、丙酮、水按4：3：1( 体积比) 的比例混合摇匀 展开系统 3：分别把正丁醇、乙酸乙脂、异丙醇、醋酸、水、吡啶按35：100：60： 35：30：30(体积比) 的比例混合摇匀 1．5 显色剂的配置 显色剂 1( 苯胺一二苯胺． 磷酸显色剂 ) ：2％二苯胺丙酮溶液： 2％苯胺丙酮溶液： 85％磷酸按 5：5：1的比例混合摇匀 显色剂 2：把10ml硫酸缓慢倒入 90ml水中混合冷却，制得 10％的硫酸溶液装瓶待 用 1，6 操作步骤 1．6．1 点样 将水解多糖、已知单糖标准液和混合单糖标准液，7种样品按一定顺序分别点样 在薄层板上点样量约 10u l ，分次滴加，使点样扩散后其直径不超过2mm 点样 过程中用吹风机使样品干燥 1．6．2 展层 将点好样品的薄层板置于密闭的层析缸中，用配置的展开剂，采用倾斜上行法， 将薄层板的下端浸在展开剂中0．3～0．5cm ，至展开剂距离薄层板的上端约1cm 左右时取出自然风干。

1．6_3 显色 在除去溶剂后的薄层板上，均匀喷上显色剂，烘箱中加热显色2 结果与分析 第三部分 多糖中还原糖的测定 ----菲林试剂法一、实验原理还原糖可以将二价铜离子还原成为一价铜反应终点可以由次甲基蓝指示，根据一定量的菲林 试剂完全还原所需的还原糖量， 可以计算加入样品中还原糖的含量二、实验器材① 菲林试剂甲液：称取 15.0g 硫酸铜（ CuSO4 ·5H2O ）,0.05 克四甲基蓝，用水溶解并稀释到 1000ml. 乙液：称取 50.0g 酒石酸钾钠， 75g 的氢氧化钠， 4.0g 的亚铁氰化钾，用水溶解并稀释到 1000ml② 0.10% 标准葡萄糖溶液：精密称取1.000g 经 95~105℃烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，移入 1000ml 容量瓶中，加入 5ml 盐酸，用水稀释到刻度，摇匀③ 滴定管、电炉、锥形瓶等三、实验步骤1．样品溶液的配备称取样品— mg ，稀释后在 100ml 容量瓶定容2. 菲林试剂的标定准确吸取菲林甲乙液各5.00ml ，置入 150ml 的锥形瓶，加水 10ml，从滴定管中预先加入约 10ml 0.1%的标准葡萄糖液，（用量控制在后滴定消耗0.10%标准葡萄糖 1ml 以内），摇匀，电炉上加热使其在2min 内沸腾。

沸腾状态下以每2s/滴的速度滴入标准葡萄糖溶液， 至蓝色刚好消失为终点， 记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积Vo同法平行操作三份，取接近的两次体积的平均值3. 预备实验准确吸取菲林甲乙液各5.00ml ，置入 150ml的锥形瓶，加水10ml，加玻璃珠 3 粒电炉上加热使其在2min 内沸腾，准备沸腾30s，趁沸以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品液(需始终保持溶液的沸腾状态) 待溶液蓝色变浅时， 以每2s/ 滴的速度滴入样品，至蓝色刚好消失为终点，记录消耗溶液的体积V14. 正式测定准确吸取菲林甲乙液各5.00ml ，置入 150ml 的锥形瓶，加水 10ml，加玻璃珠3 粒，加入（ V1-0.80 ）ml 样品液，摇匀后加热煮沸，在沸腾状态下，以每2s/滴的速度滴入样品，至蓝色刚好消失为终点重复测定两份，取总消耗标准葡萄糖溶液体积的平均值Vml一．数据记录及结果计算①菲林试剂的标定数据记录次数预加量（ ml）后滴定（ ml）总体积 Vo（ml）1 2 3 ②样品溶液的测定数据记录次数预加量（ ml）后滴定（ ml）总体积 V1（ml）1 2 3 还原糖含量（ g/ml ，以葡萄糖计）＝（ V。

V1）× 0.4 × n × 1/10 V 式中 V菲林试剂标定量， ml； V 样品糖测定量， ml； 0.4 标准葡萄糖的浓度， g/ml ； n 样品稀释倍数；有效的实验数据要求如下，V的数据与 Vo接近；后滴定 <1.00ml；平行实验中消耗样液量之差应不超过0.10ml 。