绿色银光蛋白ppt课件.ppt

绿色荧光蛋白〞让未知世界显影   Osamu Shimomura        Martin Chalfie     Roger Y. Tsien 〔钱永健〕          2019年10月8日，美Woods Hole海洋生物学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁-沙尔菲和加州大学圣地亚哥分校的钱永健三位美国科学家，由于在水母中发现和研讨绿色荧光蛋白而获得2019年诺贝尔化学奖   GFP发现之旅；           1962年，下村修初次从维多利亚多管水母Aequorea victoria 中分别出GFP他发现该蛋白在紫外线下会发出亮堂的绿光　　1992年，道格拉斯·普瑞舍克隆并测定了水母中绿色荧光蛋白的基因           1993年， Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学景象的发光遗传标志的价值在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色　　1994年，钱永健开场改造荧光蛋白，培育出黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白，了解了GFP发出荧光的机制世界上目前运用的荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。

钱永健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术维多利亚多管水母〔Aequorea victoria〕GFP简介v      维多利亚多管水母生活在北太平洋冰冷水域这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，它本身发蓝光GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实践看到的颜色GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光方式发射出来 GFP构造v蛋白序列                     SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIvGFP由238个氨基酸残基组成，分子量约为26.9kDa。

GFP构造GFP构造vGFP构造GFP构造GFP构造GFP晶体构造显示 , 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样构造 , 长 420 nm , 宽 240 nm , 由 11个β片层组成桶状构成疏水中心和由4个α螺旋以及其中一个α螺旋包含着的发光基团构成GFP构造GFP构造v桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖 , 底部由一个短的垂直片段覆盖 , 对荧光活性很重要的生色团那么位于大空腔内严密的桶形构造维护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭实验阐明 GFP 荧光产生的前提是桶状构造完好性 , 去除 N 端 6 个氨基酸或 C 端 9 个氨基酸 ,GFP 均会失去荧光这是由于生色团构成的效率较低 , 而且构成过程受外界环境影响较大的缘故   GFP构造GFP构造GFP独特的构造v由238个氨基酸组成v“像一个罐头〞v每个单体由11个反向平行的-sheets围绕，4个-helix组成，其中一个-helix位于“罐头〞内v大约长 420 nm , 宽 240 nm v荧光基团位于中心的-helixGFP构造由α螺旋含有发光基团由第 65 、 66 、 67 位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸构成生色团构成。

翻译出的蛋白质折叠环化之后 , 在 O 2 存在下 , 分子内第 67 位甘氨酸的酰胺对第 65 位丝氨酸的羧基的亲核攻击构成第 5 位碳原子咪唑基 , 第 66 位酪氨酸的α2β键脱氢反响之后 , 导致芳香团与咪唑基结合这样 , GFP 分子中构成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团 , 该过程可以自动催化完成v1. 两个野生型 GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光，在 395 nm 出现一个最大吸收峰 , 在 470 nm 出现一个小的吸收 出现两个吸收峰的缘由能够是由于存在阴性和中性两个不同化学构造的生色团由于存在两个吸收峰, 野生型 GFP 可以被规范的长波紫外 源和异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate , FITC) 所激发GFP性质v2. 可以在单独或者与其它蛋白交融时产生荧光而其最显著的特点是除了氧气之外，不需求其他辅酶，不需底物v3. Baird等研讨人员发现，虽然GFP有严密的桶状构造和构成发光基团所必需的复杂的翻译后修饰，当对GFP的N端和C端部分交换重排并以一段间隔重新衔接时，GFP依然具有荧光并且，GFP的某些位点可以耐受整段蛋白的插入，在结合金属离子的黄色荧光蛋白〔Yellow Fluorescent Protein, YFP，GFP的突变体〕中145位插入锌指构造能使荧光强度多倍提高。

v4. GFP作为报告分子具有很多优点，照实现了活细胞内基因表达和定位、荧光为蛋白的内在属性、荧光发射无种属依赖性、荧光信号对光漂白具有高抗性、检测时不需求附加辅助因子、在细菌和真核细胞中表达无明显毒性、具有高度稳定性另外，细胞内GFP的检测也比较简单，如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞分选仪等，现有报道利用实时定量PCR进展GFP荧光定量测定的方法 GFP运用1. 1. 在蛋白在蛋白质质相互作用和构型相互作用和构型变变化研化研讨讨中的运用中的运用              一种活一种活细细胞内蛋白胞内蛋白质质相互作用的研相互作用的研讨讨方法是方法是蛋白蛋白质质片断互片断互补测补测定法〔定法〔protein-fragment protein-fragment complementation assay, PCAcomplementation assay, PCA〕将标标志蛋白在志蛋白在某个位点翻开，用片断分某个位点翻开，用片断分别标别标志两个蛋白假志两个蛋白假设设被被标标志蛋白志蛋白质质相互作用，那么相互作用，那么酶酶或或荧荧光蛋白片断光蛋白片断接近并重新折叠恢复活性接近并重新折叠恢复活性。

        Hu        Hu等提出了双分子等提出了双分子荧荧光互光互补实验补实验〔〔BiFCBiFC〕〕的概念，用互的概念，用互补补的的荧荧光片断光片断标标志不同蛋白来研志不同蛋白来研讨讨bZIPbZIP和和RelRel转录转录因子家族的相互作用，确定了相因子家族的相互作用，确定了相互作用位置，信号互作用位置，信号传传送送对对作用位点的作用位点的调调理等              vv              荧荧光互光互补补不不仅仅仅仅在蛋白在蛋白质质相互作用中有所运相互作用中有所运用，用，JeongJeong等研等研讨讨人人员员以与底物以与底物结结合合时时会有典型会有典型的构象的构象变变化麦芽糖化麦芽糖结结合蛋白〔合蛋白〔MBPMBP〕〕为为模型，将模型，将MBP CMBP C端和端和N N端分端分别别与与GFPGFP片断交融片断交融结结果果证证明明参与底物的一参与底物的一组显组显示出比示出比对对照照组组更更强强的的荧荧光，由光，由此提出此提出split-GFPsplit-GFP在察看蛋白构型在察看蛋白构型变变化中的运用化中的运用   vv              另外，一种重要的另外，一种重要的荧荧光成像技光成像技术术——荧荧光共振光共振能量能量转转移〔移〔fluorescence resonance energy fluorescence resonance energy transfer, FRETtransfer, FRET〕也被广泛运用。

它可以利用〕也被广泛运用它可以利用GFPGFP及其突及其突变变体青色体青色荧荧光蛋白〔光蛋白〔CFPCFP〕、黄色〕、黄色荧荧光蛋白〔光蛋白〔YFPYFP〕等，定〕等，定时时、定量、定位、无、定量、定位、无损伤损伤地在活地在活细细胞内胞内检测检测大分子构象大分子构象变变化、蛋白之化、蛋白之间间相相互作用、信号互作用、信号传传送途径v2. GFP 在信号转导中的运用v      研讨发现 , 某些突变的 GFP 可以发生荧光共振能量转移 〔 FRET 〕，FRET 对于两个荧光分子相互间的定位和间隔高度敏感 ( 在纳米范围内 ) 两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以剧烈地改动能量转移的效率经过计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率来观测细胞动态变化的目的它消除了 GFP 分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响利用 FRET 可以作成 GFP 依赖的生物探针 , 现已有研讨人员设计大分子或分子配对物来改动 GFP 之间原有生理信号反响的 FRET            在上述实验根底上 , 研讨人员设计了FRET 依赖的 Ca 2+ 敏感指示剂 , 该实验发现 , 经过改动两个 GFP 之间的间隔 , 可添加 FRET。

另有一些研讨人员 , 并没有把两个 GFP 交融在一个单一构造中 , 而是把一个 GFP 交融到 CaM 上 , 另一个 GFP 交融到 CaM 结合区域结果发现 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 出现分子间异源二聚体 , 两个 GFP 足够接近而产生 FRET 这个实验提示了 FRET 不仅可以在分子内发生 , 而且还可在分子间发生v       最近 , 有学者用 GFP 依赖的生物传感器丈量活细胞内生化动力学 , 经过利用带有 GFP 标志的蛋白激酶 A 转染细胞 , 观测有关 cAMP 的动态荧光变化 经过交融蓝色荧光 GFP 到调理亚单位或交融绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位 , 设计出了 cAMP 传感器当 cAMP 浓度很低时 , 两个荧光分子间隔很近 , 并出现 FRET , 假设添加 cAMP 浓度 , 发生 FRET 的能够性急剧下降利用该方法 , 可以检测出 cAMP 的动态变化 , 并开创了在整体条件下 , 研讨 cAMP 调理信号转导途径的新方法      v       GFP 的构造虽然具有高度完好性 , 但是实验中发现 , 在 GFP 中某些确定的位置 , 插入外源基因 , 完全没有丧失其荧光性。

当把 CaM 插入黄色荧光 GFP 突变体中 , 得到 Ca 2+ 传感器 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 导致生色团去质子化 , 使荧光强度添加 7 倍当在黄色荧光 GFP 中插入一个 Zif268 锌指构造 , 可以得到传导 Zn 2+ 的 GFP , 结果发现荧光少量添加 , 为改动前的 1.7 倍 , K d 值约 0. 4mmol插入外源基因致使 GFP 荧光敏感性加强的景象 , 提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新途径改良 GFP 的运用前景 蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白， 褐色v1. 提高了GFP的光谱性质，v2. 提高荧光强度 v3. 提高光稳定性 v4. 颜色突变 v5. pH敏感的突变体 v       到目前为止 , 改良荧光蛋白已有非常广泛的运用 , 如转染细胞确实定 , 体内基因表达的测定 , 蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测 , 免疫分析、核酸碱基探针分析 , 以及分子间第二信使钙离子和 cAMP 程度的指示 , 细胞间隙 pH 变化的检测 另外 ,GFP 也可以和其他蛋白质构成交融蛋白 , 作为基因治疗检测目的。

但GFP 在运用中还发现有许多问题亟待处理 : v       (1) 荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难 v       (2) 多数生物具有微弱的自发荧光景象 , 并有着类似的激发和发射波长 , 这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测  v       (3) 实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株 , 能够与 GFP 参与细胞凋亡过程有关 详细研讨领域v1、骨架和细胞分裂v2、细胞器动力学和泡囊运输v3、发育生物学v4、神经生物学v5、其他运用v6、GFP 载体和技术v7、其它有用的 GFP 链接 运用GFP研讨成果美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光〞的猫        杰夫·利希曼利用荧光蛋白展现了大脑内的衔接，图片中美丽的“彩虹〞就是神经系统网络2019年在大阪大学降生的第一种发光哺乳动物小老鼠两只荧光猪诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学的实验室 约克镇科技公司消费的荧光鱼引入市场，荧光蛋白便迅速在商业上得到运用            利用GFP来发明生理传感器：一种感应离子或酸碱度程度，然后经过发出特征性的荧光来报告结果的分子机器这里所展现的分子是一种被修饰过的用来感应锌离子浓度的蓝色荧光蛋白，当红色的锌离子衔接到蓝色的被修饰过的发色团上后，蛋白质会发出亮度加强一倍的荧光从而构成容易被检测到的可见信号。

用不同的“荧光蛋白〞让未知世界显影 。