基因编辑技术简介.pdf

何小柏 江苏科技大学  ZFN （锌指核酸酶） TALEN CRISPR/CAS9 基因编辑主要技术  一、ZFN 技术  锌 指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN ） 是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌 指结构识别特异DNA 序列，再通过核酸酶 切断靶 DNA 研究者可以通过加工改造ZFN 的锌指DNA结 合域，靶向定位于不同的DNA 序列，从而使得 ZFN 可以结合复杂基因组中的目的序列，并由 DNA切割域进行特异性切割      ZFN= 锌 指DNA结合域+DNA切割域 1.ZFN的结构 锌指DNA结合域 部分 一 般 包含3 个 独 立的 锌指（Zinc finger, ZF ）重复结构， 每个锌指结构能够识别3 个 碱 基 ，因 而 一个锌指DNA结 合域 可 以 识别9bp 长 度的 特异性序列（而ZFN 二 聚 体， 则 包含6 个 锌指，可以识别18bp 长 度 的 特异 性 序 列）目前最常用的ZF 结构为Cys2His2 锌指，其结构由大约30 个 氨 基酸 包 裹一 个锌原子构成 。

 1.ZFN的结构 ZFN中应用最广泛的DNA切割域 来自IIS型限制性内切酶 FokI由于切割域与DNA链的结合能力较弱，因此DNA 切割域必须以 二聚体的形式发挥作用     非同源末端链接（non-homologous end joining, NHEJ ）  同源重组（homologous recombination, HR ） 2.ZFN技术的机制  2.ZFN技术的机制  2.ZFN技术的机制  ZFN技术具有重大的应用价值在 科研和农业领域 ， 该技术既可用于基因的敲除失活，也可用于导入目标基因， 使基因激活或阻断，或者人为改造基因序列，使之符合人 们的要求在 医疗领域，经ZFN 技术改造后导入治疗性基 因的质粒或干细胞可被导入人体，实现基因治疗此外， ZFN 技术也可以直接用于有害基因的修补替换或是直接删 除，以达到相关治疗目的ZFN技术具有极佳的特异性和 效率，因此能将基因/ 基因组错误修改的风险降到最低 从理论上来说，研究人员甚至可以在任何物种中，对处于 任意生长时期的细胞进行ZFN 操作，可以自如地修改其基 因，而还不破坏细胞状态。

3.ZFN 技术的应用  3.ZFN 技术的应用 使用ZFN 技术切割CCR5 受体的编码序列，以破坏CCR5 膜受体的功 能，使HIV 失去细胞感染能力  3.ZFN 技术的应用 使用ZFN 技术进行基因组编辑，插入小段序列将Dystrophin 基因的读 码框恢复 正常  3.ZFN 技术的应用 使用ZFN 插入HSV 的TK 基因，直接造成一条21 号染色体自发丢失；使 用ZFN 在一条21 号染色体上插入Xist 基因，使这整个染色体失去功能  4.ZFN 技术的缺陷  脱靶效应 ：ZFN 剪切的过 程并不 完全依 赖同源 二聚体 的形成 ， 所以一旦形成异源二聚体 ，就很 可能造 成脱靶 效应， 并最终 可 能导致DNA 的错配和序列改 变，产 生较强 的细胞 毒性 当这 些不良影响积累过多，超 过细胞 修复机 制承受 的范围 时，便 会 引起细胞的凋亡  ZFN 技术受到 现有生物学 领域研 究手段 的限制 ，因此 在细胞 内 部操作的精确程度和后果 都较难 预料 ZFN 技 术只能 用于体 外 操作（in vitro ），在 对人体 提取的 细胞进 行处理 之后， 再导 入回输到病人体内。

而直 接向患 者体内 导入相 关ZFN 元件进 行 基因编辑处理则具有较大 的潜在 风险， 且效率 不高  TALEN 靶向 基因 敲 除 TALEN 技术 基于TALEN ( 转录激活样效应因子 核酸酶，transcription activator-like (TAL) effector nucleases) 的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学 工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核 酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程  TALEN技术的发现 TAL效应因子（TAL effector, TALE ）最初是在一种 名为黄单胞菌（Xanthomonas sp. ）的植物病原体中作 为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的这些 TALE 通过细菌 III 类分泌系统（bacterial type III secretion system ）被注入植物细胞中，通过靶定效应因 子特异性的基因启动子来调节转录，来促进细菌的集落 形成由于TALE 具有序列特异性结合能力，研究者通 过将FokI 核酸酶与一段人造TALE 连接起来，形成了一 类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN 1989年，从植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp. ） 中 克隆 avrBs3 基因。

 TALEN技术的发现 2009 年 Xanthomonas TA氨基酸序列 与核酸靶序列的对应关系被破译 TALEN 发展过程 2011 年8 月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行 基因敲除 的4 篇研究文章，另加一篇综述 • 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 》 • 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 》 • 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 》 • 一篇综述 《Move over ZFN 》 TALEN 的最前沿  1. TALEN结构 典型的 TALEN 由一 个包含 核定位信号 （Nuclear localization signal, NLS）的N 端结构域、 一个包含可 识别特定 DNA 序列 的典型串联 TALE 重复序列的中 央结构域，以及一个 具有FokI 核酸内切酶 功能的C 端结构域组 成 。

 2. TALEN技术的原理与步骤 TALEN 技术是通过 DNA 识别模块将TALEN 元件 靶向特 异性的 DNA 位点 并 结合，然 后在FokI 核酸 酶的 作用下 完 成特 定位点的 剪切 ， 并借助于细胞内固有 的同源定向修复（HDR ）或非同 源末端 连接 途径（NHEJ ）修复过程完成特定 序列的 插入 （或倒置）、删失及 基因融合 TALEN 靶向（基 因敲除 ）技术 基本流程 1. 选择、确定靶点 2. TALE 识别模 块串联 构建 3. TALEN 真 核表达 质粒构 建 4. TALEN 真 核表达 质粒转 入 （卵）细胞，表达TALEN 重组蛋白 5. 检测突变效率，筛选 （移码）突变体 X 2 X 2 X 2 Mut Mut靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp 的两段14-18bp序列作为靶点 参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 靶点选择设计软件：https://boglab.plp.iastate.edu/node/add/talef-off/ 选择确定TALE 靶点  TAL的核酸识别单 元 为 间隔32 个恒定氨 基酸残基的二联氨基 酸 （RVD ）  RVD 与A 、G 、C 、 T 有恒定的对应关系， 即NI 识别A ，NG 识别T ， HD识别C ，NN 识别G ， 非常简单明确  欲使TALEN 特异 识别某一核酸序列 （靶点），只须按照 靶点序列将相应TAL 单 元（14 -18个）串联 克隆即可。

TAL靶点识别 模块的构建 TAL靶点识别模块的克隆与表达 完整 的TALEN 元件包括 一对TAL 靶 点识别 模块、N 端的核 定位序 列、C 端的 FokI 酶 一般来说，我们 可以采 用专门 用于构 建TALEN 的真核 表达载 体体 系，将一对特异性的TAL 靶点识 别模块 克隆进 该载体 中，再 通过转 染等方 式导入细胞内这种体系 一般由 供体质 粒（donor plasmid ，提供单基、二 联及三联等类型的TAL 模 块）和 骨架质 粒（backbone plasmid ，用于构建 TALEN 并表达构建好的TALEN ）两 类质粒 构成， 常用的TALEN 体 系有 RCIscript-GoldyTALEN 和pC-GoldyTALEN 、TAL5-BB 和pTAL6-BB 及 pCS2TAL3-DD 和pCS2TALE-RR等 具专利保护的克隆构建系统 步骤一：靶点识别单元串联 步骤二：TALEN 表达质粒构建 具专利保护的克隆构建系统 FokI TAL 靶点识别模块 FokI FokI TAL 靶点识别模块 将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。

此真核表达载体含 有TAL 的其它必需结构域并在C 端融合有FokI 序列 目前，TALEN 系统利用FokI 的内切酶活性打断目标基因因FokI 需形成2 聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔 17碱基）的靶序列（14 - 18 个碱基）分别进行TAL 识别模块构建 X 2 真核表达TALEN质粒对 步骤三. 将TALEN 质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除 TALEN 质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA 靶位 点并与靶位点特异结合此时，两个TALEN 融合蛋白中的FokI 功能域形成 二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因 FOKI 内切酶打断靶点区 内切 酶的切割诱发DNA 损伤修 复机制 （nonhomologous end-joining ，NHEJ ）由于 在此修过程中总是有一定的错误率存 在在 修复 中发生移码突变错误的个体即形成目 标基因 敲除 突变体 突变体形成 PCR – 酶切法 • 利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的 特异性内切酶位点，进行PCR产物酶切鉴定 • 当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用 CEL-I 核酸酶检测。

• 经验规律：>= 2% 可用，>=10% 很好 Mut Mut TALEN 切割效率检测 TALEN 切割效率检测 启动子 – ABCDEF – stop-Target site - DEFHIJK 启动子 – ABCDEFHIJK 共转染 荧光素酶检测质粒 + TALEN 质粒 1 + TALEN 质粒 2 荧光素酶检测法 发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究 有文献表明，发光倍数达1.5 至2 倍即可有效获得突变体。