皮肤角质形成细胞的原代培养.doc

角质形成细胞原代培养的准备工作补充培养基的配制：（1） 将0.5ml浓度为0.06M的CaCl2加入到500ml基础培养基中， 则培养基中CaCb浓度为0.06mM；（2） 将5mlHKGS （人的角质形成细胞生长添加剂）加入到基础培养 基中3） 向其中加入50ul双抗（100x）,使培养基中双抗比例为1% 胶原涂层培养瓶：（1） 在超净台无菌操作下，向培养面积为25cm2的细胞培养瓶中先 加入1. 7m 1稀释液，再向其中加入17ul胶原（培养面积为75cm2 的培养瓶先加5ml稀释液，再加50ul胶原）；（2） 来回剧烈摇晃使胶原蛋白均匀分布于培养瓶表面，拧紧瓶盖在 室温下孵育30min；（3） 从培养瓶中吸取出多余的胶原或稀释液；涂层后的培养瓶可立 即使用，或者短时间内放置于2°C-8°C备用消化液：0. 025%胰酶+0. 01%EDTA可用（0. 25%月夷酶+0. 1%EDTA）稀释十倍得到其中的百分比表示质量体积比，即0. 25%胰酶表示0. 25g胰酶 溶于 lOOmlPBS 溶液；0. 1%EDTA 表示 0. IgEDTA 溶于 lOOmlPBS 溶液终止消化液：含10%血清的DMEM或含10%血清的PBS溶液 冻存比例：80%含细胞的培养基+10%血清+ 10%含DMSO的冻存液皮肤角质形成细胞的原代培养复苏（1） 将装有皮肤角质形成细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37°C温水中来回摇动（将冻存管下半部分浸入温水中），使其 在2min内完全融化。

2） 用1ml移液枪将冻存管内已融化液体全部转移至15ml离心管 中，再向冻存管中加入lml已配置好的补充培养基，用移液枪 反复冲洗后也转移至离心管内3） 进行1500r, 5min离心;弃上清，加入补充培养基后，再次离心, 反复两次；离心后可观察到离心管底部的细胞团4） 向离心管中加入lml补充培养基，用移液枪反复吹打使细胞重 悬，分散均匀；从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝 稀释，用细胞计数器测定lml培养基中的活细胞数；用配置好 的补充培养基稀释离心管中细胞数为1.25X 104/ml,向培养面 积为25 cn?的已被胶原涂层细胞培养瓶里加入5ml细胞悬液5） 轻轻摇动细胞培养瓶使细胞均匀分散开；放置于37°C,5%CO2 的细胞培养箱里培养，24h勿动，待细胞贴壁后可换液换液刚复苏的细胞可在24h-36h后换液；随之在48h后换液；之后每 隔…天换一次液，直至细胞覆盖培养瓶表面50%； —旦细胞覆盖培养 瓶表面达到50%,则保持每天换液直至细胞覆盖培养瓶表面达到80% o传代(1) 当细胞覆盖培养瓶表面达80%时，弃除培养瓶中的培养基2) 向培养瓶中加入lml消化液(0.025%胰酶+0・01%EDTA),用 1ml移液枪吹打洗一遍之后吸出弃除，再向培养瓶中加入lml 消化液(0.025%胰酶+0・01%EDTA),摇匀使培养瓶表面被覆盖。

室温下孵育并在显微镜下观察，直至观察到细胞变圆，大概 4-5min,轻轻摇晃培养瓶把贴壁的细胞全部消化下来3) 向培养瓶中加入lml胰酶抑制剂(含10%血清的DMEM或 PBS),然后把被消化下来的细胞转移到15ml离心管中4) 再向培养瓶中加lml胰酶抑制剂(含10%血清的DMEM或 PBS),用移液器进行冲洗，将含有细胞的溶液也转移至15ml 离心管中5) 进行1500r, 5min离心，可观察到离心管底部的细胞团，弃上 清后用PBS洗两遍，离心，弃除上清6) 加入lml培养基后重悬细胞，用lml的移液器反复吹打使细胞 浓度均匀7) 从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数 仪测定1011培养基中的细胞数；计算好之后用补充培养基稀释 细胞悬液，以细胞数为1.25X 104/ml个进行传代8) 轻轻摇动细胞培养瓶使细胞均匀分散开；放置于37°C,5%CO2 的细胞培养箱里进行培养冻存（1） 当细胞覆盖培养瓶表面达80%时，弃除培养瓶中的培养基2） 向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0・01%EDTA）,用 lml移液枪吹打洗一遍之后吸出弃除，再向培养瓶中加入1ml 消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA）,摇匀使培养瓶表面被覆盖。

室温下孵育并在显微镜下观察，直至观察到细胞变圆，大概 4-5min,轻轻摇晃培养瓶把贴壁的细胞全部消化下来3） 向培养瓶中加入lml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或 PBS）,然后把被消化下来的细胞转移到15ml离心管中4） 再向培养瓶中加lml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS）,用移液器进行冲洗，将含有细胞的溶液也转移至15ml 离心管中5） 进行1500r, 5min离心，可观察到离心管底部的细胞团，弃上 清后用PBS洗两遍，离心，弃除上清6） 加入lml培养基后重悬细胞，用lml的移液器反复吹打使细胞 浓度均匀7） 从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数 仪测定，并计算出离心管中的全部细胞数；（8） 重悬后弃除适量细胞悬液，使离心管中留有800ul细胞悬液； 再向其中加入100ul jflL清和100ul含10%DMSO的冻存液后重 悬并全部用lml移液枪转移到冻存管中，做好标记9） 将冻存管先悬于液氮表面过夜后放置于液氮中进行保存。