肠道病原菌的分离与鉴定课件.ppt

肠道病原菌的分离与鉴定一肠道病原菌的分离与鉴定一l培养基的制备及常用培养基培养基的制备及常用培养基l细菌的培养法细菌的培养法 EMB培养基的制备培养基的制备 肠道病原菌的分离与鉴定（一）肠道病原菌的分离与鉴定（一）l血清学检测血清学检测-肥达氏反应肥达氏反应1肠道病原菌的分离与鉴定培养基的制备培养基的制备(一一)肉汤培养基肉汤培养基l材料：鲜牛肉、蛋白胨、氯化钠、材料：鲜牛肉、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、试纸、10％碳酸氢钠、试％碳酸氢钠、试管、三角烧瓶、蒸馏水等管、三角烧瓶、蒸馏水等l方法方法 1．将新鲜牛肉．将新鲜牛肉500g切碎或搅碎，加水切碎或搅碎，加水1000ml，放，放4℃℃冰箱或冷冰箱或冷处浸泡过夜，然后煮沸处浸泡过夜，然后煮沸30min，放凉，使残余的脂肪凝固，再，放凉，使残余的脂肪凝固，再用绒布或滤纸过滤，将滤液补足为原量用绒布或滤纸过滤，将滤液补足为原量 2．．1000ml肉水中肉水中加入蛋白胨加入蛋白胨10g、氯化钠、氯化钠5g，加热溶解加热溶解 3．用精密．用精密pH试纸测酸碱度，用试纸测酸碱度，用10％碳酸氢钠校正％碳酸氢钠校正pH为为7.2左左右。

过碱时，可用右过碱时，可用10％醋酸校正之％醋酸校正之 4．分装于试管中或三角烧瓶中，．分装于试管中或三角烧瓶中，15磅磅(121℃℃)高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌20～～30min 2肠道病原菌的分离与鉴定高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器3肠道病原菌的分离与鉴定(二二)普通琼脂培养基普通琼脂培养基l材料：肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂、无菌平皿、灭菌试管、材料：肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂、无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等三角烧瓶等l方法方法 1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶中，加热溶化中，加热溶化 2．用．用pH试纸测酸碱度，用试纸测酸碱度，用10％碳酸氢钠校正％碳酸氢钠校正pH为为7.2左右 3．．15磅高压蒸气灭菌磅高压蒸气灭菌20～～30min 4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内，每个平皿倒入约．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内，每个平皿倒入约15ml，凝固后即成普通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒，凝固后即成普通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上，凝固后即成普通琼入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上，凝固后即成普通琼脂斜面培养基。

脂斜面培养基4肠道病原菌的分离与鉴定(三三)血液琼脂培养基血液琼脂培养基 有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基进行培养不良，可用血液琼脂培养基进行培养l材料材料 ①① 普通琼脂培养基普通琼脂培养基 ②② 血液血液(脱纤维羊血或兔血脱纤维羊血或兔血) l方法方法 1．加热溶化普通琼脂培养基．加热溶化普通琼脂培养基 2．待冷至．待冷至50℃℃左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀(注意勿使产生泡沫注意勿使产生泡沫) 3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基5肠道病原菌的分离与鉴定E.M.B琼脂培养基的制备琼脂培养基的制备l成分成分 蛋白胨蛋白胨 10g 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 2g 琼脂琼脂 20g 乳糖溶液乳糖溶液(20％％) 50ml 伊红溶液伊红溶液(2％％) 20ml 美蓝溶液美蓝溶液(0.5％％) 20ml 蒸馏水蒸馏水 1000mll制法制法 ①①将蛋白胨和磷酸氢二钾加温溶化于蒸馏水中将蛋白胨和磷酸氢二钾加温溶化于蒸馏水中 ②②校正校正pH值为值为7.6加入琼脂加入琼脂 ③③煮沸溶化过滤后分装三角瓶中，每瓶定量分装煮沸溶化过滤后分装三角瓶中，每瓶定量分装 ④④15磅磅30min高压灭菌高压灭菌 ⑤⑤以无菌操作法按量加入经以无菌操作法按量加入经10磅磅20min高压灭菌的乳糖、伊红美兰液，高压灭菌的乳糖、伊红美兰液，混匀后倾注平皿备用。

混匀后倾注平皿备用6肠道病原菌的分离与鉴定E.M.B培养基培养基l原理原理 大肠杆菌能分解乳糖产酸，使培养基大肠杆菌能分解乳糖产酸，使培养基pH值下降，值下降，伊红与美蓝相结合成一种复合物，酸性环境中，菌伊红与美蓝相结合成一种复合物，酸性环境中，菌体带正电，易与伊红结合，故菌落呈紫黑色或紫红体带正电，易与伊红结合，故菌落呈紫黑色或紫红色，并有金属光泽碱性环境中伊红与美蓝不结合，色，并有金属光泽碱性环境中伊红与美蓝不结合，病原菌不分解乳糖，不产酸故菌落为无色半透明病原菌不分解乳糖，不产酸故菌落为无色半透明其次，伊红、美蓝有抑制革兰氏阳性菌生长的作用其次，伊红、美蓝有抑制革兰氏阳性菌生长的作用l用途用途 用于分离肠道致病菌，是一种鉴别培养基并有弱用于分离肠道致病菌，是一种鉴别培养基并有弱的选择作用的选择作用7肠道病原菌的分离与鉴定8肠道病原菌的分离与鉴定肥达氏反应l肥达氏反应通常用已知的伤寒杆菌肥达氏反应通常用已知的伤寒杆菌“O”、、“H”菌液和甲、菌液和甲、乙型副伤寒杆菌乙型副伤寒杆菌“H”菌液与病人血清作定量凝集试验菌液与病人血清作定量凝集试验(试试管法管法)，以检测病人血清中有无相应抗体存在，根据抗体，以检测病人血清中有无相应抗体存在，根据抗体含量多少及增长情况用于伤寒、副伤寒病的辅助诊断。

含量多少及增长情况用于伤寒、副伤寒病的辅助诊断l材料材料 ①①待检可疑伤寒病人血清待检可疑伤寒病人血清(1:10稀释稀释) ②②诊断菌液：伤寒杆菌诊断菌液：伤寒杆菌“O” (O) 伤寒杆菌伤寒杆菌“H” (OH) 甲型副伤寒杆菌甲型副伤寒杆菌“H” (PA) 乙型副伤寒杆菌乙型副伤寒杆菌“H” (PB) ③③生理盐水生理盐水 ④④吸管，小试管等吸管，小试管等 9肠道病原菌的分离与鉴定方法方法l本实验四人一组，每人取本实验四人一组，每人取6只小试管，排成一列，计四列只小试管，排成一列，计四列为一完整试验分别标明每列管号和诊断菌液如为一完整试验分别标明每列管号和诊断菌液如“O”、、“OH”、、“PA”、、“PB”按下表先向每管加生理盐水按下表先向每管加生理盐水0.5ml，再加，再加10倍稀释病人血清倍稀释病人血清0.5ml于第于第l管，做顺序的管，做顺序的等倍稀释，最后加入等量的诊断菌液，充分混匀，置等倍稀释，最后加入等量的诊断菌液，充分混匀，置37℃℃ 2~4h，再放室温，再放室温24小时后观察结果。

小时后观察结果 试 管管123456生理生理盐水（水（ml））0.50.50.50.50.50.5病理血清病理血清10X（（ml））0.5↘ ↘0.5↘ ↘0.5↘ ↘0.5↘ ↘0.5↘ ↘0.5→弃去弃去诊断菌液（断菌液（ml））0.50.50.50.50.50.510肠道病原菌的分离与鉴定。