细胞破碎技术论文汇总.docx

概讲细胞破碎技术1. 细胞破碎技术的概述细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放 出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产3. 细胞破碎技术的发展现状目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎破碎 方法可规纳为机械法和非机械法两大类目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度 和安全性，也决定着产品的收率与成本许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外， 而保留在细胞内破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放 其中的目标产物自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质 的飞跃，生物产品的数量越来越多，许多具有重大应用价值的产品应运而生，如具有显著医疗 作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一 2等,它们的基因分别在宿主细胞（如大肠 杆菌或酵母细胞）内克隆表达成为基因工程产物，从而提高了产量，降低了成本很多基因工 程产物都是胞内物质（如上述药物经克隆表达后都属胞内物质），分离提取这类产物时，必须 将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取。

因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤, 破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注2. 常见的细胞破碎阻力不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同由难到易的大致排列顺序为：植物细胞〉真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌〉革兰氏 阴性细菌〉动物细胞2・1.细菌细胞破碎阻力几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链 （glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形 状和强度短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨酰-D -谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸 而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网 状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度， 如果交联程度大，则网结构就致密2.2. 酵母菌细胞破碎阻力酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具 有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6 一磷酸二酯 键共价连接，形成网状结构在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到 网状结构上，也可以不连接。

与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构 交联的紧密程度和它的厚度2.3. 真菌细胞破碎阻力霉菌的细胞壁主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以P -1,3糖苷键连接，某些以p -1,6 糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白最外层是a -和p -葡聚糖的混合 物，第2层是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层主要是蛋白质，最内层 主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞 壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高2.4・植物细胞细胞破碎阻力对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分初生壁是细胞生长期形 成的次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构目前，较流行的初生细胞壁 结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型，依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞 壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方 向不同，互成一定角度，形成独立的网络，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构 蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸 交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网 络系统。

半纤维素和果胶等胶体则填充在网络之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹 性在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧 密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积因此次生壁的形成提高了细胞 壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度4. 常见的细胞破碎方法4.1机械法（1）高压匀浆破碎法高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵用高压原理对细胞进行挤压和 排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节细胞浆液通过止逆阀进入泵体内， 在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击， 使细胞受到高的液相剪切力而破碎在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通 过等方式，也可连续操作为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度 调节在20r左右在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静 止期的细胞，常采用多次循环的操作方法2) 振荡珠击破碎法将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中， 再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积，用6500RPM振荡机高速上下振动8秒，休息8秒， 再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法.一台机器最多可以在一 天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便.(3) 高速搅拌珠研磨破碎法研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快 速搅拌，使细胞获得破碎。

在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机4) 超声波破碎法用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液超声波振荡器有不同 的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的 作用是把电磁振荡转换成机械振动超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型 式，一般破碎效果后者比前者好4.2.非机械法(1) 渗透压冲击破碎法渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘 油或蔗糖溶液)，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡 后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速 渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂2) 冻融破碎法将细胞放在低温下冷冻(约■15°C)，然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用由 于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水 结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法3) 酶溶破碎法酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗 透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。

溶菌酶适用于革兰氏阴性菌细 胞的分解，应用于革兰氏阳性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁真核细胞的 细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶4) 化学破碎法采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等 化学试剂5) 去垢剂破碎法蛋白质复性利用包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋 白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、 核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了从这个角度上讲，包含体的形成对 分离纯化亦有好处.5. 选择破碎细胞方法的原则(1) 破碎对象的细胞结构，不同结构的细胞破碎方法不同2) 破碎细胞过程中，对目的物的破坏程度3) 提取物需要的保护条件4) 破碎温度应控制破碎温度，以防目地物活性损伤，甚至失活5) 适宜的细胞破碎条件应该从高产物释放率，低能耗和便于后步分离与提取这三方面 来衡量6. 细胞破碎技术的进展以上比较可以看出，适合大规模工业应用的细胞破碎技术主要是球磨破碎、冷压释放破 碎和高压释放破碎，目前已有工业规模和实验室使用的设备，可满足同规模的需要而其它 技术主要是在实验室使用，但由于某些技术对特定的产物和生物细胞有很好的适用性，在工 业上应用也获得了成功。

因此，细胞破碎技术的选择还需依据具体的产物和细胞特性与破碎 技术的适应性进行综合考虑来决定每种细胞破碎技术都有不足和应用的局限性即使工业上应用的破碎技术，如球磨破碎、 冷压释放破碎和高压释放破碎等，虽然有破碎效率高、成本低、简便等优点，但也有其不足， 如因细胞破碎度高，胞内含物全部释放，大量的杂蛋白和核酸的释放使破碎物粘度很高，给 后序的固-液分离带来困难，给产物分离纯化增加了负担；机械破碎的剪切力高，或因产生 大量热量，易造成敏感的生物活性物质的失活化学法虽然目前主要在实验室内小规模应用， 大规模工业应用还存在许多问题，但也有许多独特的优点因此，细胞破碎技术本身还远未 达到完善的地步，还有大量的工作可做如纳米级微生物细胞破碎机就是对细胞破碎技术的 改进近几年有关文献仍然不少，特别是从上游和下游以及细胞破碎技术之间的相互融合和联 系出发，发展了一些新的方法主要从两个方面进行改进发展：(1) .由上游解决的技术避开细胞破碎工艺：主要是将具有融菌作用的葡聚糖酶基因导入宿主，或利用基因工程 技术破坏酿酒酵母的与细胞壁形成有关的KNR4基因，使重组细胞的通透性明显提高，可用 于进行胞外蛋白质的生产。

细胞自溶：为了省略细胞破碎工艺，采用基因修饰法，控制细胞溶解如质粒EclEl 的自杀基因Kil的基因产物可使细胞完全溶解耐高温产品的基因表达：利用蛋白质工程和基因工程使基因产品具有耐高温的特性， 在破碎细胞过程中，不必使用低温冷冻系统，可以节省可观的能耗，降低成本；同时其它杂 蛋白因受热变性，这可简化后序的分离纯化工艺控制发酵和细胞培养条件：细胞膜壁的结构和组成与细胞培养的条件，如培养基组成、 生长期、pH、温度、溶氧、搅拌等有着密切关系，控制适当条件即可控制细胞耐受破碎的能 力该法在理论上讲比较容易，在实际使用上比较困难，需要做大量的探索工作2) 与下游技术相结合将细胞破碎和双水相萃取融合，即在细胞破碎前制备细胞悬浮液时，按双水相组成的要 求加入PEG和其它成相组份，利用球磨或其它方法进行细胞破碎参考文献[1] 修志龙，姜炜，苏志国.细胞破碎技术的研究进展和发展方向.辽宁：大连理工大学[2] 曾俊华，王昌禄,张民等.酵母细胞破碎方法对S-腺苷-L-蛋氨酸提取的影响.天津:天津 科技大学食品科学与生物工程学院[3] 姚洪文，郭素格，范玉梅.酵母细胞破碎技术的研究.河北：河北科技大学[4] 陈伟平，陈必链,张艳燕.三种微藻细胞破碎方法的比较.福建:福建师范大学生命科学学 院[5] 李宏君，尹际彤,杨启东.细胞破碎方法简述.黑龙江：哈药集团技术中心[6] 林楠.细胞的破碎.色谱世界。