基于全基因组测序的肺结核病原学诊断.pdf

基于全基因组测序的肺结核病原学诊断产品介绍泽塔生物科技（上海）有限公司二零一七年二月肺结核病原全基因组测序诊断简介耐药结核 (Drug-resistant tuberculosis) 是控制结核病一个重要的挑战除耐多药结核(MDR-TB)外 泛耐药结核(XDR-TB)也在近年出现耐药结核的临床管理十分复杂 处方药物有耳毒性，肾毒性，肝毒性，致泻，呕吐及生理失调等副作用在没有获得药物敏感试验结果之前，患者可能被迫接受无效并带有副作用的化学治疗 如果有一种病原检测方法，可以一次性进行所有的药物抗性测试，并且在临床所需要的短时间内返回医师富有诊断价值的信息，那么这对患者是十分有益的 分枝杆菌的耐药性基本上是其自身的遗传突变导致的，这使得遗传学检测能够得到可靠的表型信息根据已发现的遗传突变开发，已经有商业化的，经过FDA许可，WHO推荐的结核分枝杆菌遗传检测试剂盒出售由于技术本身的局限，市场销售的基于探针/引物的分子诊断，药物敏感试验只检测有限的几个目标区域，得到有限的药物敏感测试结果2a12a12a14-6a14-6a1 2a11-3a1 1-3a1a2a0a3a4a6a5a7DSTa9a0a3a4a6a5a7DSTMGIT/MiSeqa10a8 MiSeq a12a11MGITa14a13a16a15a14a13MGITa14a13MGITa14a13 MGITa14a13DST(a18a17a19a20)a22a21 5 - 9 a1a22a21 10 - 16 a1MGITa14a13 MGITa14a13DSTa16a15a14a13a23DST(a25a17a19a20)图 1: 全基因组测序和现有鉴定药敏手段周期比较微生物全基因组测序方法使得结核一站式诊断成为现实。

通过对培养阳性的分枝杆菌进行全基因组测序，不仅可以获得直接的一线和二线抗结核药物的耐药信息，还可以获得高分辨率分子分型现实中的感染，由于相当比例的NTM的存在，进行菌种特异性的遗传突变-表型推测变得困难ZetaBio使用自行开发的通用微生物基因组鉴定及分析系统MicrobeTrakr完成微生物WGS数据分析工作 使用ZetaBio的专利技术可以跳过传统的培养鉴定步骤，直接利用WGS数据得到可靠的微生物鉴定(根据 FDA/CDC/NIST 正在建立的标准)得到可靠的物种识别后，MicrobeTrkar使用其内嵌的的物种特异性遗传突变知识库进行表型推断知识库中，所有的蛋白序列及突变知识全部经过专家人工和计算机程序校订MicrobeTrkar 是通用微生物鉴定分析系统，所以无论输入的检材实际是何种微生物，都可以得到正确的鉴定及表型推断这使得NTM，口腔寄生菌污染造成的MGIT培养阳性得到区分，提供史无前例的诊断分辨力为快速获阳性培养，我们目前建议使用分枝杆菌快速培养生长指示管（MycobacterialGrowthIndicator Tube，MGIT）进行原始检材的微生物培养工作，然后对培养阳性的样本进行微生物全基因组测序检验。

MicrobeTrakr 现在可以接受 1Illumina® 及 2PacBio®RS 系列测序设备WGS文库策略的测序输出数据尚不接受 3OxfordNanopore®系统的原始数据，但可接受基因组拼装1Illumina Inc. 的注册商标2Pacific Biosciences的注册商标3美国牛津纳米孔公司的注册商标2  全基因组测序 线性探针 4GeneXpert MGIT液体培养 固体培养实验通量 高 中 低 较高 中药敏检测 一线、二线药物 INH/RIF RIF 一，二和三线药物 一，二和三线药物NTM鉴定 是 否 否 否 否基因分型 是 否 否 – –测试成本 较高 中 较高 较低 低污染影响 较小 小 小 大 中检验周期 2-3周 2-3天 2-3小时 3-4周 6-8周表 1: 病原学诊断手段比较业务模式ZetaBio 提供微生物WGS的数据分析API服务，同时接受数据递交方式的数据分析工作如果客户单位没有测序能力，ZetaBio可以使用自身的供应链提供收样测试服务 如果提供生物样本，需要根据有关规范对其进行灭活处置步骤 周期MGIT培养阳性样本 7-10d提取培养基总DNA 2hIllumina MiSeq/HiSeq测序 3-7d数据传输及分析 1-2h总周期 3w表 2: 技术流程（拥有测序设备的诊断实验室）性能微生物全基因组测序在诊断性能上超过任何其他检验手段。

除了可以直接鉴定感染的是何种分枝杆菌（47种，见表5），解决多年一直困扰临床的问题之外（临床培阳样本中含有20%左右的NTM）对于肺结核诊断， MicrobeTrakr检验MTB的32个耐药相关蛋白（见表4），并根据近1000个突变知识点（见表3例子）对受测样本进行抗性表型判断，远超任何使用分子探针的技术 使用全基因组测序技术的优势：• 识别分枝杆菌假阳性• 比培养节省30天时间• 完全评估32个耐药相关基因• 数据分析通量每天196个样本• 帮助制定合理的化疗方案蛋白 位置 突变及影响INHA 94 S → A: 造成 INH 和 ETH 抗性INHA 148 D → G: 造成 吡啶霉素 抗性INHA 158 Y → A: 催化活性降低1500倍INHA 158 Y → F: 催化活性降低24倍INHA 158 Y → S: 不影响催化活性表 3: 精细可靠的突变知识库结核分枝杆菌耐药相关蛋白RS12 UPPP LPRG PANDFLQE2 RPOB CH10 GYRASIGF WHB7A EMBC DRRABLAC EMBA NAT DNAKA85B AFTA RECA LEXAINHA TYSY GREA DNAE2AAC2 SYI SSB FLQE3KATG EMBB MMR TIG表 4: TB耐药检测Panel结果样例微生物鉴定的金标准是DNA-DNA杂交。

Mi-crobeTrakr使用模拟DDH的全基因组比对ANI进行物种鉴定避免了由于特定分子标记保守性以及分辨率不足导致的鉴定错误，也由此保证了基因组表型推断的可靠性参见图2图 2: 基于ANI的细菌鉴定药物抗性信息由耐药基因的相关数据计算得出，提供直接能指导化疗方案制定的信息商品化的分子生物学诊断试剂盒已经在结核诊断上大量使用，由于全基因组测序实际检验的靶标和突变和基于探针法或PCR方法的靶突变一致，因此在实际性能上有不低于任何商品化分子诊断试剂盒的表现参见图3图 3: DST预测伴随得到的高分辨率分子分型可以帮助医师判断二次感染或是输入性病例传统技术得到相关诊断信息需要额外的人力，设备以及额外的试剂成本参见图4图 4: 基因间隔区寡核苷酸分型（spoligotyping）可准确鉴定的分枝杆菌物种学名Mycobacterium aviumMycobacterium aurumMycobacterium abscessusMycobacterium aromaticivoransMycobacterium arupenseMycobacterium asiaticumMycobacterium bovisMycobacterium brisbanenseMycobacterium chelonaeMycobacterium chlorophenolicumMycobacterium chubuenseMycobacterium colombienseMycobacterium cosmeticumMycobacterium elephantisMycobacterium fortuitumMycobacterium genavenseMycobacterium gilvumMycobacterium gordonaeMycobacterium haemophilumMycobacterium hassiacumMycobacterium heckeshornenseMycobacterium heraklionenseMycobacterium intracellulareMycobacterium iranicumMycobacterium kansasiiMycobacterium kyorinenseMycobacterium lepraeMycobacterium lepromatosisMycobacterium mageritenseMycobacterium marinumMycobacterium mucogenicumMycobacterium nebraskenseMycobacterium neoaurumMycobacterium obuenseMycobacterium parascrofulaceumMycobacterium phleiMycobacterium rhodesiaeMycobacterium septicumMycobacterium setenseMycobacterium simiaeMycobacterium sinenseMycobacterium smegmatisMycobacterium thermoresistibileMycobacterium triplexMycobacterium tuberculosisMycobacterium vaccaeMycobacterium vanbaaleniiMycobacterium xenopi表 5: 可直接鉴定的NTM物种。