实验五 食品中沙门氏菌的检验.docx

实验五 食品中沙门氏菌的检验一、实验目的要求1、了解食品的质量与沙门氏菌检验的意义2、掌握沙门氏菌的生物学特性3、掌握沙门氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断4、掌握沙门氏菌属血清学试方法5、 掌握食品中沙门氏菌检验的方法和技术二、原理沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆 菌种类繁多，少数只对人致病其他对动物致病，偶尔可传染给人主要引起人类伤寒 副伤寒以及食物中毒或败血症在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第 二位食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤：1 前增菌；2 选择性增菌；3 选择性 平板分离沙门氏菌；4 生化试验，鉴定到属；5 血清学分型鉴定目前检验食品中的沙门 氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位三、试剂和仪器一)最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml 广口瓶1个稀释样品2、500ml 三角瓶1个制缓冲蛋白胨水3、250ml 三角瓶8个制增菌液、培养基4、15X 150mm 试管18支制三糖铁培养基和PH7.2尿素5、13X 130mm 试管30 支制蛋白胨水等6、 1ml 移液管5支7、 10ml 移液管2支8、直径为 90 mm 平皿12套制 BS 、 SS 平板9、 250ml 量筒1支二)应灭菌的其它器材剪刀 1 把 不锈钢汤匙1 把 称量纸适量三)应准备的培养基和试剂冷辛甘h貝 培养基总量所用容器1.缓冲蛋白胨水(BP)：1瓶225ml/瓶500ml 三角瓶2.氯化镁孔雀绿(MM)增菌液：1瓶100ml/瓶250ml 三角瓶3.亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：1瓶100ml /瓶250ml 三角瓶4.亚硫酸铋琼脂(BS)： 4皿1瓶60ml/瓶250ml 三角瓶5.SS 琼脂： 6 皿1瓶100ml /瓶250ml 三角瓶6.三糖铁琼脂：6支6ml/支40ml15X150mm 试管7.尿素琼脂（pH7.2）：6支4ml /支25ml15X150mm 试管8.蛋白胨水：6支2ml/支20ml13X 100mm 试管9.氰化钾（KCN ）培养基：6支4ml /支30ml13X130mm 试管10.氨基酸脱羧酶试验培养基（赖氨酸）：6支1ml /支 10 ml13X 130mm 试管11.氨基酸脱羧酶试验培养基（不含赖氨酸）：6支1ml/支 10 ml13X130mm 试管12.沙门氏菌因子血清：多价血清；11种因子血清。

按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型四、实验内容样品处理ff前增菌ff选择性增菌ff选择性平板分离ff生化学试验ff血清学试验鉴别ff结果报告第一天 样品处理和增菌培养（一） 样品处理1、 加工过的样品：冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌称取检样25g,加在装有225mL 缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内固体食品可先应用均质器以8000〜10000r/min打碎lmin, 或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化,备用2、 未加工样品：鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌各取25g（25mL）加入灭菌生 理盐水25mL，按前法做成检样匀液，备用二） 、前增菌和增菌1、 加工过的样品：冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌•接种操作：将混均匀的稀释样液放在36±1°C培养4h（干蛋品培养18〜24h）；移取 10mL,转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液（MM）或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18〜 24h同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸增菌液（SC）内• 培养：于36±1C培养18〜24h2、 未加工样品：鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。

• 接种操作：取25mL匀液，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液（MM）或四硫磺酸钠 煌绿增菌液内，于42°C培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）内• 培养操作：于36±1C培养18〜24h第二天 接种选择性平板进行分离培养一）分离培养•接种操作：取前天增菌培养的增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板(BS) 和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)两种增菌液可同时划线接种在 同一个平板上• 培养操作：于36±1°C分别培养18〜24h(DHL、HE、WS、SS)或40〜48h(BS),观察 各个平板上生长的菌落第三天 观察分离结果，从平板上挑取可疑菌落接种到：三糖铁琼脂、蛋白陈水、尿素琼 脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)和赖氨酸脱羧酶试验培养基(一)、观察分离结果 典型的沙门氏菌菌落形态如下：A、 在HEKTOEN氏肠道菌(HE)琼脂上 菌落呈兰绿至兰色，带或不带黑色中心许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落B、 亚硫酸铋(BS )琼脂上 产硫化氢的菌落为黑色，有时带有金属光泽，呈褐色，灰色或黑色菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。

C、 SS 琼脂上： 无色半透明；产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色二)、五项生化试验• 接种操作：1、 接种三糖铁琼脂：从选择性琼脂平板上，直接挑取2个或更多个菌落，分别接种三 糖铁琼脂用一空白培养基作对照试验用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位，接种TSI斜面，先在斜面上划线，再于 底层穿刺不需灼烧接种针，接种后面四项生化培养基2、 接种蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸 脱竣酶试验各用一空白培养基作对照试验接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化 钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管•培养操作：于36±1C培养18〜24h，必要时可延长至48h• 革兰氏染色与镜检：从平板上挑取可疑菌落进行革兰氏染色与镜检第四天 观察五项生化试验结果，判断沙门氏菌属性，做血清学试验(一)、观察五项生化试验结果 1、在三糖铁琼脂内，符合沙门氏菌属种的反应结果见表1表1沙门氏菌属种在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气产硫化氢可疑为沙门氏菌属和种—++/—+沙门氏菌属+++/—+沙门氏菌II—++—沙门氏菌属—+——伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(h2S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结 果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。

2、符合沙门氏菌属的五项生化试按表2判定结果，沙门氏菌属五项生化试的结果应符合Al、A2和B1，其他反应结果 均可以排除表 2 沙门氏菌属种生化反应初步鉴别表反应序号H》靛基质尿素(pH7.2)氧化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶判定菌属A1+———+沙门氏菌属A2++——+沙门氏菌属(少见)B————+沙门氏菌属、u1—————甲型号副伤寒沙门氏菌属符合反应序号％，为沙门氏菌属典型反应，判定为沙门氏菌属细菌如尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾(KCN)和赖氨酸脱羧酶试验三项中，有一项异常，按表3可判定沙门氏菌: 表3尿素(pH7.2)氧化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶判定菌属———甲型号副伤寒沙门氏菌—++沙门氏菌IV或V+—+沙门氏菌个别变体、二)、血清学分型鉴定1、抗原的准备一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如 2.5%一 3%)培养基上再检查；如果是 由于Vi抗原的存在而阻止了 0凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL生理盐水中做成浓菌液，于 酒精灯火焰上煮沸后再检查H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%〜0.8%半固体琼脂平板 的中央，候菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%〜0.4%半固 体琼脂的小玻管1〜2次，自远端取菌培养后再检查。

2、0 抗原的鉴定操作：用A〜F多价0血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照在生理盐水中自 凝者为粗糙形菌株，不能分型玻片凝集试验图被A〜F多价0血清凝集者，依次用04； 03、10； 07； 08； 09； 02和011因子血清做 凝集试验根据试验结果，判定0群被03、10血清凝集的菌株，再用010、015、034、 019单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个0抗原成分的最后确定 均应根据0单因子血清的检查结果，没有0单因子血清的要用两个0复合因子血清进行核对不被A〜F多价0血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价0 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的0群血清逐一检查，以确定0 群每种多价0血清所包括的0因子如下：0多价1 A，B，C，D，E，F群（并包括6, 14群）0 多价 2 13，16，17，18，21群0 多价 3 28，30，35，38，39群0 多价 4 40，41，42，43群0 多价 5 44，45，47，48群0 多价 6 50，51，52，53群0 多价 7 55，56，57，58群0 多价 8 59，60，61，62群0 多价 9 63，65，66，67群五、思考题1 、如何提高沙门氏菌的检出率？2、 沙门氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？解释这些现象？3、 沙门氏菌检验有哪5个基本步骤？4、 食品中能否允许有个别沙门氏菌存在？为什么？。