白细胞预激与非适应性反应的实验研究.doc

精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询白细胞预激与非适应性反应的实验研究【摘要】 目的 观察中性粒细胞粘附活性和杀伤效应在大鼠严重创伤后的动态变化规律，探讨中性粒细胞致敏与活化不同功能状态下的生物学标记对创伤的预警意义方法 采用多处骨折和广泛软组织挫伤建立大鼠严重创伤模型，分别于创伤后 2、4、8、12、24h 不同时相点采集血标本；攻击组于体外 LPS 攻击 PMN 模拟“二次打击” ；检测各组 PMN 释放 O2-和 PMN-EC 的粘附活性的变化结果 创伤组2、4h 时相点中性粒细胞体外自发释放 O2-自由基量和 PMN-EC 粘附活性与基础表达值无明显改变，8、12、24h 时相点明显增多（P 0.05） ，而 8、12、24h 时相点则显示上述指标均较对照组明显增加；LPS 攻击组显示各相应时相点 O2-自由基释放量、PMN-EC 粘附百分率均较其对照组呈不同程度升高；尤其是 2、4h 时相点较同组其他时相点增加更为明显（P 0.01） ，且较创伤组明显增加（P 0.01） 结论 创伤早期 PMN 处于致敏状态，表现为活性氧的释放能力显著增加和 PMN-EC 的粘附活性明显上调。

【关键词】 创伤 中性粒细胞 预激 致敏 活化 内毒素 大鼠【Abstract】 Objective To observate the changes of release O2- of PMN and PMN-EC adhesion activity at rats 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询with multiple trauma.It’s valuable that providing theoretical instruction for clinical treatment,and expecting a new road for prevention and treatment of severe injury by exploring the mechanism and biomarker of PMN priming.Methods Adopting murine modles of multiple broken-bone and soft tissue injury, the basal levels of PMN O2- release were found in unstimulated PMN harvested from health rats. Systemic blood was collected at 2、4、8、12、24h after trauma. With LPS challenge the PMN harvested at various times in vitro（second hit）. The methods used in the study are as follows: 1. In vitro release O2- of PMN was messured by ultraviolet spectroscopy. Results PMN-EC adhesion activity and spontaneous in vitro O2- release by PMN harvested from trauma rats at 2 and 4hours after injury was also quite low.In contrast, which modestly increased at 8,12 and 24 hours after injury (P 0.05), the above changes all remained higher than that of control group at 8,12 and 24hours after injury. Also, LPS challenge PMNs that expressed more O2-than control,especialy significant elevations at 2 hours、4 hours after injury,compared with control group,PMN-EC adhesion activity all were markedly enhanced at various 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询times after injury,especialy the denotes data at 2 and 4 hours,that are significantly different (P 0.01) from the other various times. Conclusion The injury to PMN was a role of priming early trauma, and PMN become primed for enhanced superoxide release and the up-regulation of PMN-EC adhesion activity.【Key words】 trauma;neutrophil granulocyte;priming;primed;activation;endotoxin;rat中性粒细胞（PMN）存在三个功能状态，即静息（quiescent） 、致敏（primed） 、活化（activited） ［1］ 。

机体受到伤害的早期，创伤作为初始刺激对 PMN 产生预激（Priming）作用使 PMN 处于致敏状态，对随后的刺激产生应答反应即进入活化或过度活化状态本实验观察白细胞对创伤预激的非适应性反应的变化规律，为探讨创伤后全身炎症反应综合征（SIRS）的预警意义拓展一个新思路1 材料与方法精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1．1 实验动物及创伤动物模型制备 健康成年 Sprague-Dawley大鼠 90 只，体重（250±30）g，雌雄不限，由第二军医大学实验动物中心提供本实验动物模型参照文献［2］方法作改进动物术前 12h 禁食，自由饮水；伤后不限制进食、饮水用自制的夹钳夹大鼠的肢体，造成双侧股骨+双侧胫腓骨+双侧肱骨的多发性闭合型骨折和软组织挫伤，建立创伤动物模型1．2 主要试剂及器材 LPS 由 Sigma 公司提供；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)为上海前进试剂厂产品；Percoll 细胞分离液、Dextran T 500 为 Pharmacia 公司产品； DU-640 型紫外分光光度计由美国Beckmen 公司生产1．3 实验方法1．3．1 实验分组 创伤组(Trauma) (n=6)：创伤后不同时相点精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询采集血标本分离 PMN；LPS 攻击组(Challenge) (n=6)：创伤后不同时相点采集血标本分离 PMN + 体外 LPS (100ng/ml)攻击；对照组(Control) (n=6)：以上各实验组分别设相应的对照；除未致伤大鼠外，余处理方法与各对应实验组相同。

1．3．2 标本采集 实验动物随机分组(n=6)；分别于创伤后2、4、8、12、24h 不同时相点断头活杀采集血标本，经 Percoll 梯度离心法分离中性粒细胞，制成 1×107cells/ml 细胞悬液中性粒细胞的分离及 PMN 纯度活力鉴定基本方法见 Haslett 法［3］ ，采用Haslett 法测定的 PMN 纯度及活力均 92%1．3．3 内皮细胞培养及鉴定 采用大鼠主动脉血管组织块贴壁法参考文献［4］方法作改进实验所用内皮细胞为传代培养第五代，并经 PAP 法鉴定Ⅷ因子相关抗原无阴性缺损区1．3．4 PMN 产生 O2-自由基的测定 利用紫外分光法检测 O2-自由基，根据文献［5］方法以氧化型 NBT（NBT+）间接表示 O2-生成量精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1．3．5 PMN-EC 粘附活性的测定 根据文献［6］方法检测中性粒细胞与内皮细胞的粘附率表示其粘附活性粘附率=（粘附前的细胞计数－洗脱液细胞计数）÷粘附前的细胞计数×100%1．4 统计学分析 实验结果以均数±标准差（x±s）表示，采用Base 统计软件包进行完全随机资料的方差齐性检验（F 检验） ，组间计量资料均数比较均采用 t 检验。

2 结果2．1 创伤后大鼠 PMN 产生 O2-的动态变化 创伤组 2、4h 时相点PMN 释放 O2-自由基量无明显变化； 8、12、24h 时相点明显高于对照组（P 0.05） ；攻击组各时相点 O2-自由基量较其对照组均显著升高，尤其是 2、4h 时相点相差非常显著（P 0.01） ；与创伤组相应的时相点比较相差非常显著（P 0.01） （Fig.1） 2．2 创伤后大鼠 PMN-EC 粘附活性的动态变化 创伤组 2、4h 时精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询相点 PMN-EC 粘附百分率与其对照组比较无明显变化，8、12、24h时相点明显增加（P 0.05） ；攻击组各时相点 PMN-EC 粘附百分率较其对照组均显著升高，尤其是 2、4h 时相点升高显著（P 0.01） ，且明显高于创伤组（P 0.01） （Fig.2） 注：*P 0.05 ＃P 0.01 vs control *P 0.01 vs 8，12，24h ）注： *P 0.05 ＃P 0.01 vs control *P 0.01 vs 8，12，24h3 讨论3. 1 创伤动物模型的建立 自 1992 年 Deitch 提出二次打击学说以来，利用二次打击建立标准化的和符合临床实际的创伤后双向迟发 MODS 动物模型一直是创伤引发 SIRS、MODS、MOF 研究中的难题［7］ 。

迄今为止，创伤后 MODS 动物模型与临床 MODS 的最大区别在于动物遭受致伤因素打击后没有强有力的器官支持措施，因而难以度过最初的休克或单器官衰竭而早期死亡，使可能发展到 MODS 的自然过程中断本实验参照文献［2］方法，建立严重创伤（或多发性创伤）动物模型以创伤作为初始打击，体外用 LPS 攻击从创伤后大鼠血液精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询中获得的中性粒细胞，以模拟内毒素对 PMN 的二次打击（second hit） ［8］ 实验动物采用同系 SD 大鼠，个体差异小，采用自制的可控性夹钳为致伤工具，确保各动物的致伤程度一致，以减少系统误差；根据简明创伤分度（AIS）评分四肢多发性长骨闭合型骨折为严重创伤，所以本实验以夹钳致伤大鼠六处骨折和软组织挫伤，造成大鼠的严重创伤作为对机体的第一次打击（first hit） ，刺激因素较单一，基本排除了象临床上液体复苏、药物治疗等干扰，同时也体现了以动物作为实验对象的优点，更有利于研究工作对实验条件的控制上一页 1 2 下一页3.2 PMN 预激及其功能状态的变化 一个细胞对初次损害有准备称预激（Priming） ［9］ ，预激是指一个细胞首先接触不利因素并能改变该细胞对随后刺激的应答反应，初始刺激可导致其对损害的构建适应性和损害的非适应性反应，从而表现为细胞的各种功能状态。

PMN 存在三个功能状态［1］ ，即静息（quiescent） 、致敏（primed） 、活化（activited） 在生理情况下，由于炎细胞的活化有明显的自限性，机体内中性粒细胞（PMN）的发生、激活、灭活、凋亡都维持在均衡水平然而，机体受到伤害的早期，创伤作为初精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询始刺激对 PMN 产生预激作用使 PMN 处于致敏状态，Hallett［10］把致敏比如交。