液相色谱质谱联用.ppt
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概 述LC-MS联用机遇与挑战LC ： 适用面广，但定性能力差MS： 定性能力强，但分析混合物时效果差LC-MS 通过LC的分离，使MS可以分析具有大量杂质的混合物中的待 测物，并提高分析的专一性和灵敏度； LC可以分离同分异构体，弥补了MS的不足 GC-MS : 样品必须气化 不适合极性、热不稳定和大分子化合物20%） LC-MS：不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合 物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广 HPLC MS 高压液相操作 质量范围无限制 常使用无机盐缓冲液高真空测定质量取决于m/z和质谱类型需要采用挥发性盐 LC/MS 联用的主要困难 LC-MS 接口 (Interface)类型 API (atmosphere pressure ionization)ESI (electrospray ionization)APCI(atmospheric chemical ionization)热喷雾(TSP)、等离子体喷雾(PSP)、粒子束(LINC)和动态快原子轰击(FAB)等。
LC-MSLC-MS各种联用技术的比较各种联用技术的比较 技术流速/mL.min-1 样品类型适用的分子量范围/u热喷雾(TSP)1～2极性水溶物如药物、代谢物<1,000等离子体喷 雾(PSP)0.5～2极性小于TSP分析的样品<1,000粒子束 (LINC)0.2～1非极性物质，如农药、脂肪酸<1,000大气压化学电 离(APCI)0.2～2低极性物质，如农药、偶氮染料、药物<1,000动态快原子轰 击(FAB)0.001～0.01极性物质，如肽类<10,000电喷雾(ESI)0.001～1肽类、蛋白质、寡核苷酸、糖类、药物等<200,000 Electrospray ionization(ESI) ESI 将溶液中的离子转变为气相离子,进行MS分析，最软的质谱离子化技术Tayler 锥(电泳机制） 2~4kV0.1mm2 cm1、 液体表面带电2、带电雾滴形成3、雾滴蒸发4 、气相离子从微小的雾滴产生LC-MS 中常用电离技术 §不同表面张力溶剂的起始电位（不同表面张力溶剂的起始电位（c ＝0.1mm, d=40mm)溶剂 ／(N/m)Uon(kV)溶剂 ／(N/m)Uon(kV)CH3OHCH3CN0.02260.0302.22.5(CH3)2SOH2O0.0430.0733.04.0 ESI 所需电位所需电位为使Taylor发生静电喷雾，在毛细管尖端需施加的起始电位： 溶剂表面张力 Taylor 锥的半角0 真空介电常数c 毛细管半径 ESI 实验条件优化实验条件优化１、待测物质在溶液中的状态（溶液化学） 待测物质在供试品溶液中以离子状态存在，可提高生成气相离子的效率，提高检测灵敏度。
B + RCOOH BH++RCOO- HA + NH3 A- +NH4+ 2、 溶剂的表面张力 纯水，因表面张力高，所需起始电位Uon高，易产生放电现象； 常用水－甲醇（50:50)溶剂，同时黏度也下降，有利于雾化．3、 溶液流速 低流速产生细雾滴，有利于产生气相离子，提高信号灵敏度； 高流速范围内，为提高雾化效率，需采用高速同轴气流辅助雾化技术4、 雾滴的蒸发速率 提高 雾滴蒸发速率的方法：采用挥发性溶剂；提高“干燥气”温度和流速； 使用加热金属毛细管 5、 气相离子的产生 竞争机制——表面活性高（最低溶剂化能）的离子优先转移至雾滴表面， 最 终转变为气相离子，故有较高的实验灵敏度 1、 应采用表面活性低的缓冲剂 2、 采用低浓度的挥发性酸、碱及缓冲盐 3 、 用高纯度的溶剂、试剂 4、 样品应作预处理，除去干扰物及盐。
Atmospheric chemical ionization (APCI) 样品溶液借助雾化气的作用，喷入高温（如500℃）蒸发器中，此时溶剂和溶质均为蒸气，由63Ni放射源或放电电极产生低能电子使试剂气，如N 2、O2、H2O、或溶剂B 等离子化，经复杂的一系列反应使溶质产生正或负离子 N2+e- N2+ +2e- A+BH + AH ++B (质子转移） A+B + A + +B(电荷转移） Ｍ＋Na +, M+NH4+、M+Ac-、 M+Cl-等 APCI ： 适用于小分子极性较低的化合物（醇、醚等）ESI ： 热不稳定或难于气化的极性化合物 ESI和APCI共同点:1、使用高电压元件和雾化气喷雾法产生离子2、通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子3、产生极少的碎片，但可以控制产生结构碎片４、非常灵敏的电离技术。
不同点:1、生成离子的方式不同，ESI：液相离子化；APCI：气相离子化2、样品兼容性ESI：极性化合物和生物大分子,多电荷离子APCI：非极性，小分子化合物（相对ESI而言）且有一定挥发性， 要产生的是单电荷离子 基体辅助激光解吸电离(MALDI) 1988年，Hilenkamp 和Tanaka 发明，可将热不稳定分子完整地携带进入气相的离子化技术．操作过程：样品与基质（1:100-50,000)均匀混合，点在样品靶子上，空气干燥，送入离子源基质吸收激光能量-——基质离子——碰撞——样品质子化形成分子离子及分子离子的多聚体 基体作用：1 在选定波长激光照射下，基体对激光能量有很强的吸收，而分析物一般只有很弱的吸收2 基体对分析物起到溶剂溶剂的作用，减少了分析物分子间的相互作用，减少了分析物簇群形成可能性3由于基体浓度远高于分析物，因而确保了激光大部分能量被基质吸收而最小限度地照射分析物4 基质常为有机弱酸，作为质子化试剂质子化试剂，在分析物离子的形成过程中具有重要作用 LC-MS中的色谱技术20世纪80年代商品化，迅速成为应用最广泛的联用技术LC-ESIMS灵敏度影响因素：灵敏度影响因素： 质量型检测器：响应与待测组分的质量流速成正比， 如FID、FPD。
浓度型检测器： 检测器响应与流动相中待测成分的浓度成正比如 UV、TCD APCI ：质量型检测器----------4.6mm i.d.色谱柱； ESI： 表观行为为浓度性检测器---------- 细径色谱柱（１mm i.d. 或更细）； 进入喷雾器的质量流速； 气化样品离子 离子化效率 可使用柱后分流，不会导致信号损失． LC-ESI MS技术技术 2-25 m纯电喷雾熔融二氧化硅涂金1nL ~1 L/min低流速：低流速：LC-ESIMS流速选择流速选择毛细管液相色谱（Cap-LC)和毛细管电泳（CE)与MS联用；样品量有限、灵敏度优先考虑时使用： 如肽图谱测定 50-100 m1 ~200L/min 气动辅助（离子喷雾）中等流速：中等流速：微柱液相色谱与MS联用；适合于既要高灵敏度又需要较大柱容量的工作：如药物代谢定性定量分析（1~２.1mm) 高流速：高流速：气动辅助＋热辅助500℃200 ~ 2mL/min雾滴周围的温度尽管有几百度，但当溶剂蒸发时，雾滴会冷却，其温度通常不超过 50℃，所以有机化合物不会热降解．样品量充足、可鉴定微量杂质：４.6mm i.d. 如何将如何将HPLC 方法转化为方法转化为LC-ESIMS1、 缓冲剂 硫酸盐、磷酸盐及硼酸盐——醋酸铵、甲酸铵、三氟乙酸（TFA）、七 氟丁酸（HFBA）、氨水、氢氧化四丁基胺（TBAH)等代替2、 pH 值 通常应保持不变3、离子对试剂 挥发性的如HFBA 、 TBAH，但保留时间有波动4、有机溶剂 基本匹配5、色谱柱 离子交换柱（高离子强度）、蔬水相互作用色谱蔬水相互作用色谱（盐浓度梯度） 6、 柱后修饰 作用： 调节pH值以优化正负离子检测； 添加异丙醇以利于含水溶剂的去溶剂化、稀释缓冲盐； 添加醋酸钠（50mol/L)使缺乏或只有弱质子化位点的样品阳离子化(Ｍ＋Ｎa+) 填充毛细管柱色谱或毛细管电泳，需在柱后添加适当溶剂（补足液流）以达到稳定的喷 雾，以提高质谱响应。
装置： 三通、输液泵 LC-API MS中的质谱技术ESI 和APCI 均为大气压离子化（API）技术，与经典的离子源不同，需要有从大气压至真空的接口及离子传输等装置1、电喷雾和高电压的连接 2 、喷雾针的位置和去溶剂方法带电雾滴进入质谱仪会撞击离子光学元件或质量分析器，产生离子脉冲，在质谱图中出现尖峰信号ESI 雾滴的去溶剂可采用热氮气流或加热取样毛细管（防堵塞）等方法 3 、大气压离子源与真空的连接-自由喷射膨胀 M Mach碟与取样孔距离D0 取样孔 内径 p0 上游（大气压）的压强 p1 下游（真空）的压强 4、簇离子问题 产生：APIMS 与LC、CE 等联用时，在离子源中有溶剂与水蒸气，由于自由喷射膨胀 而迅速冷却，极性分子将与离子簇合 防止簇离子的产生-气帘 剥离簇离子上的溶剂分子-碰撞诱导解离（collision induced dissociation, CID） 在取样孔和取样锥（或取样孔和离子光学元件）之间加一电场，离子在电场作用下被加速。
簇合物与随机运动的背景气碰撞而被“加热”，可导致氢键的断裂 如果电场较高，不仅剥离溶剂分子，而且也导致样品离子的裂解，这种由样品离子生成 碎片离子的技术称为源内（in source )CID 分离大分子物质(如蛋白质)时,碰撞能分配在大量的振动自由度上,不会导致大分子的裂解. 5、仪器调谐和质量坐标的校准 GC/MS PFTBA （全氟三丁胺） LC/APIMS ： 质量范围宽且分布均匀PEG 重复单元 CH2CH2O 生成一系列相差44u 的PEG+Na+离子 NaI 用簇离子 Na+(NaI)n ，I- (NaI)n 作为 校准物 生成一系列相差150u 的离子. 。
