微生物计数USP61中文版.doc

微生物计数检测需氧菌总计数USP<61>USP<61>中文版 美国药典微生物限量 61）微生物限度检测 （MICROBIAL LIMIT TESTS） 此章提供措施来检测也许存在的好氧微生物其她制药过程中也许浮现的微生物的数量，涉及原材料和成品中的如果通过验证确承认以得到相似或更好的检测结论，也容许采用自动化的检测措施在样品检测过程中须进行无菌操作若无特别阐明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的鉴定，阐明“存在和也许存在活的微生物” 准备实验 (Preparatory Testing) 本章波及实验成果的有效性取决于：提供的被检测样品自身在实验条件下，被充足证明不会克制也许存在的微生物的生长因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合规定的实验条件，接种稀释样品到具有如下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。

措施如下： 将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不不不小于 10-3 稀释的微生物培养物，加 1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）相应培养基培养失败则需要采用如下措施更改检测程序： （1） 增长稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者 （2） 中和一定数量的干扰因子；或者 （3） 结合（1）、（2）得出合适条件，使接种物得以生长 如下是某些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、制止物质发挥抑菌作用： 大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯 20（polysorbate 20, 4.0%）然后反复前面的实验，用液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯 20（Fluid Casein Digest-Soy lecithin-Polysorbate 20 Medium）论证待测样品里的防腐剂或其她抑菌因子被中和若产品中具有抑菌物质且产品是可溶性的，则采用“无菌实验（Sterility Tests <71>）”里的“薄膜过滤法 (Membrane Filtration Method)”进行(微生物限度)检测会更合适（suitable）。

在抑菌物质得以合适中和、稀释液体积大幅度增长后仍不能排除克制因子，以及不合合用“薄膜过滤法”的状况下，也许会由于产品自身的杀菌作用导致细菌无法生长当产品不能检测出接种菌种的状况下，应用光谱法拟定产品的抑菌/杀菌成分 缓冲液和培养基 (Buffer Solution and Media) 按照下列配方配制培养基，或者使用规范厂商生产的培养基干粉进行培养基配制，所使用的干粉培养基应当与在此列出的培养基成分比例相似 在按列出的配方进行培养基配制时，用水溶解固体物质，必要时可以加热以得到完全溶解的均匀溶液在使用前用盐酸或氢氧化钠将培养基的pH值调节到规定范畴，调节 pH 值应在 25±2条件下进行 若培养基配方有琼脂，应使用湿度不超过 15%的琼脂溶解水为纯化水（Purified Water）PH 7.2 磷酸(盐)缓冲液储藏液—称34g 磷酸二氢钾于 1000mL 容量瓶，加水 500mL 溶解用氢氧化钠TS 调节pH 至7.2±0.1（约 175mL），然后加水至容量瓶刻度，混匀分装溶液后灭菌冰箱保存 培养基 除另有指出，培养基应在高压灭菌器中加热灭菌。

见<1211>“灭菌”章节中的“蒸汽灭菌”）保存时间（exposure time）取决于培养基的灭菌体积 1、 液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯 20 培养基 酪蛋白胰酶消化物------------------20g 大豆卵磷脂---------------------------5g 聚山梨醇酯 20-----------------------40mL 水---------------------------------------960mL 将胰腺酪蛋白消化物和大豆卵磷脂溶解于 960mL 水中，48~50℃水浴加热约 30 分钟得均匀溶液加 40mL 聚山梨醇酯 20，混匀，按需要分装 2、 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物------------------15.0g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物---------5.0g (Papaic Digest of Soybean Meal) 氯化钠---------------------------------5.0g 琼脂------------------------------------15.0g 水---------------------------------------1000mL 灭菌后 pH 值：7.3±0.2 3、 液体大豆酪蛋白消化物培养基 按照<71>无菌实验里的措施进行配制。

Soybean Casein Digest Medium under Sterility Tests<71>. 酪蛋白胰酶消化物------------------17.0g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物---------3.0g 氯化钠---------------------------------5.0g 磷酸氢二钾---------------------------2.5g 葡萄糖（C6H12O6 H2O）--------2.5g 纯化水---------------------------------1000mL 4、 甘露醇-盐琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g 动物组织胃蛋白酶消化物---------5.0g 牛肉膏---------------------------------1.0g D-甘露醇------------------------------10.0g 氯化钠---------------------------------75.0g 琼脂------------------------------------15.0g 酚红------------------------------------0.025g 水---------------------------------------1000mL 混匀，搅拌加热，煮沸 1 分钟得均匀溶液。

灭菌后 pH 值：7.4±0.2 5、 Baird-Parker 琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g 牛肉膏---------------------------------5.0g 酵母膏---------------------------------1.0g 氯化锂---------------------------------5.0g 琼脂------------------------------------20.0g 氨基乙酸（糖胶）------------------12.0g 丙酮酸钠------------------------------10.0g 水---------------------------------------950mL 搅拌加热，煮沸 1 分钟灭菌，冷却至 45~50℃，然后加入 10mL 灭菌后的亚碲酸钾（1:100）和50mL 乳状蛋黄轻柔混匀， 6、 Vogel-Johnson 琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g 酵母膏---------------------------------5.0g 甘露醇---------------------------------10.0g 磷酸氢二钾---------------------------5.0g（Dibasic Potassium Phosphate） 氯化锂---------------------------------5.0g 氨基乙酸（糖胶）------------------10.0g 琼脂------------------------------------16.0g 酚红------------------------------------25.0mg 水---------------------------------------1000mL 溶解后煮沸 1 分钟。

灭菌，冷却至 45~50℃，然后加 20mL 灭菌后的亚碲酸钾（1：100） 灭菌后 pH 值：7.2±0.2 7、 溴棕三甲铵琼脂培养基 白明胶胰酶消化物------------------20.0g 氯化镁---------------------------------1.4g 硫酸钾---------------------------------10.0g 琼脂------------------------------------13.6g 溴棕三甲铵---------------------------0.3g Cetyl Trimethylammonium Bromide (Cetrimide) 丙三醇---------------------------------10.0mL 水---------------------------------------1000mL 将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸 1 分钟得均匀溶液 灭菌后 pH 值：7.2±0.2 8、 假单胞菌琼脂培养基 检测荧光生二氢荧光素 酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g 动物组织胃蛋白酶消化物---------10.0g 无水磷酸氢二钾---------------------1.5g硫酸镁（MgSO4·7H2O）-------1.5g 丙三醇---------------------------------10.0mL 琼脂------------------------------------15.0g 水---------------------------------------1000mL 将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸 1 分钟得均匀溶液。

灭菌后 pH 值：7.2±0.2 9、假单胞菌琼脂培养基 检测绿脓菌溶素 白明胶胰酶消化物------------------20.0g 无水氯化镁---------------------------1.4g 无水硫酸钾---------------------------10.0g 琼脂------------------------------------15.0g 丙三醇---------------------------------10.0mL 水---------------------------------------1000mL 将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸 1 分钟得。