束永前ngs肺癌临床应用束永前wsppt课件.ppt
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1NGS在肺癌精准医疗中的应用江苏省人民医院--束永前 高通量测序技术的发展及研究报道高通量测序技术在肿瘤临床的应用1目录Table of Contents3 DNA测序技术的演化和爆发性增长DNA Sequencing Technology has Grown Rapidly and Exponentially4一代二代三代 Sequencing Gets Cheaper and Faster单人全基因组测序成本（美金）：HGP:$3 Billion2004:$30,000,0002008:$100,0002010:$10,0002011:$4,000 2014:$1,000???: $100测序成本迅速下降，超过了摩尔定律Cost is Decreasing Exponentially, Beating Moore’s Law5 62013年NEJM发表的临床文献，43%运用高通量技术目前高通量测序大量应用于国内外临床癌症研究 21世纪的癌症分型需要病理和分子联合进行 – ASCO 2014, Chicago, Dr. M Stratton (英国首相医学顾问） 7在不同病理类型中，肺癌驱动基因突变谱存在明显的差异 NSCLC腺癌基因突变谱：亚洲研究与欧美人群不同，EGFR依然是亚裔腺癌最常见的驱动基因Koh Y, et al. 2013 ASCO Abstract 7572. Wu YL, et al. 2011. 140例日本肺腺癌370例中国肺腺癌BRAF M+2%PI3K M+4%C-MET Amp5$PTENM+6%EML4-ALK7%KRAS7%EGFR M+40%未知29%KRAS17.6%EGFR43%PIK3CA14.1%MLH14.9%STK116.3%CTNNB15.6%GNAS0.7%PTPN110.7%VHL11.4%SMAD41.4% 早期肺腺癌中EGFR突变率和晚期相似Zhang X, et al. 2013 ASCO Abstract 1547. Yang PC, et al. 2012 ASCO Abstract 1534.2013 ASCO早期NSCLCICANEGFR突变状态 (%)2012 ASCO晚期NSCLCPIONEEREGFR突变状态 (%) 8023：NTRK1基因融合作为肺癌新的癌基因靶点•结论-在肺腺癌中通过NGS/FISH发现了一种新的癌基因NTRK1融合-需要开展更多研究以明确NTRK1融合在肺癌中的发生率和特征-该研究提示需要在NTRK1融合阳性患者中开展前瞻性Trk抑制剂的临床研究35例泛阴性(EGFR, KRAS, ALK, ROS1)肺腺癌样本新的Break-Apart FISH检测 第2代测序技术(CLIA认证实验室)对表现为新NTRK1基因融合的细胞进行转录及药理抑制分析56 例泛阴性(EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET)肺腺癌样本Doebele RC, et al. 2013 ASCO Abstract 8023.3/91 (3.3%) 肺鳞癌驱动基因突变研究•71肺鳞癌病人标本•NGS和定量PCR检测突变和基因扩增基因名称突变频率TP5359.2%PI3KCA19.7%FGFR21.4 %HRAS2.8%APC 1.4%KRAS1.4%MET1.4%EGFR4.2%AKT11.4%PTEN1.4%SMAD41.4%KIF5B-RET1.4%FGFR31.4%基因名称变异类型频率CDKN2A缺失/突变/甲基化72%PI3KCA突变16%PTEN突变/缺失15%FGFR1扩增15%EGFR扩增9%PDGFRA扩增/突变9%CCND1扩增8%DDR2突变4%BRAF突变4%ERBB2扩增4%FGFR2突变3%Koh Y, et al. 2013 ASCO Abstract 7572. Govindan R, et al. 2012 ASCO Abstract 7006.2013 ASCO•178例肺鳞癌标本•127例（75%）患者确认潜在治疗靶点•检测基因拷贝数，外显子突变，mRNA表达和启动子甲基化2012 ASCO40.9% 的鳞癌患者存在联合基因突变，表明了鳞癌患者基因型的复杂性 12NSCLC中FGFR1基因拷贝数增加475例已行手术切除的I-III期NSCLCl多因素分析，在校正吸烟、性别和肿瘤大小后，伴FGFR1基因扩增的I/II期肺鳞癌患者的OS显著长于FGFR1未扩增的患者（HR=0.26; 95% CI: 0.08-0.84, P=0.02）l18%的脑转移出现FGFR1拷贝数增加，而相应原发部位无增加Tang XM, et al, et al. 2013 ASCO Abstract 7552.FISH & IHC检测FGFR1基因扩增 13手术切除的肺鳞癌患者中FGFR1扩增对预后的影响•63例经组织病理学证实、临床已切除肺鳞癌•评估FGFR1状态与临床特征#和DFS*之间的关系•FGFR1扩增定义为FGFR1拷贝数≥2.2xCEP8拷贝数结果：•FGFR1扩增与年龄(p>0.99)、性别(p>0.99)、吸烟史 (p=0.32) 或疾病分期 (p=0.18)之间无相关性•多因素分析发现，FGFR1扩增与DFS改善显著相关 (HR 3.2, 95% CI 1.1‐9.4)Hellmann MD, et al, et al. 2013 ASCO Abstract 7559.*Log-rank，#Fisher’s 精确检验 PI3K通路驱动IV期肺鳞癌患者的转移模式和生存•68例 IV期 肺鳞癌患者的FFPE肿瘤标本-FGFR1 扩增 (FISH)-PIK3CA 突变 (Sequenom)-PTEN 缺失 (IHC)-PTEN 突变(外显子测序)•采用Kaplan-Meier法估算生存率•采用Log-rank检验和Cox比例风险法 进行组间比较Paik PK, et al. 2013 ASCO Abstract 8022. PI3K通路驱动IV期肺鳞癌患者的转移模式和生存•OS单因素分析：•OS多因素分析：考虑到年龄、性别、KPS因素后，仍然显示PI3K与生存期短相关-HR = 3.3，(95%CI:1.5-7, p=0.03) l转移部位的驱动基因分析-脑转移在鳞癌中不常见，但在 PI3K异常肿瘤高达22%-脑转移仅出现在PI3K异常肿瘤Paik PK, et al. 2013 ASCO Abstract 8022.OS 95%CIP值(vs 其他)FGFR1扩增19.510.8-NR0.059PI3K9.498.1-NR0.004其他13.79.7-NR结论：•IV期PI3K异常肺鳞癌患者的生存较差•脑转移在PI3K异常的患者中更常见，且仅出现在PI3K异常的患者中•PI3K通路活化具有不同的生物学特点，以该通路为靶点的治疗方法可能是伴脑转移的肺鳞癌患者的一种有效治疗策略 小结•在不同病理类型中，肺癌驱动基因突变谱存在明显的差异•即使同样的病理类型中，东方人群与西方国家人群(高加索人种)并不完全相同•常见的突变基因方面，EGFR突变在亚裔(包括中国)人群中的发生率明显高于白种人群(30% vs. 17%), 而K-RAS突变则在白种人群的发生率远高于亚裔人群•鳞癌患者的基因型较腺癌或更加复杂，其对生存的预后预测作用更加明显 靶向治疗耐药后基因突变研究•针对驱动基因突变研制的分子靶向药物在晚期NSCLC 治疗方面已经显现出巨大的优势。
•表皮生长因子受体(EGFR)敏感突变的患者，可从EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗中获得更好的疗效，但几乎所有患者迟早均要发生EGFR-TKI获得性耐药，中位无进展时间只有8~12个月•当靶向治疗后出现耐药时，临床上面临众多治疗困惑，也是当今肺癌个体化治疗的研究热点之一 靶向治疗耐药机制（1）EGFR二次突变，例如20外显子T790M、T854A、L747S、D761Y等2）下游信号传导通路基因突变，例如RAS、RAF、PI3CA、PTEN等3）旁路激活，例如HER2扩增或突变、MET基因扩增、ALK基因融合 ROS1基因融合、 AXL基因扩增等4）表皮间质化（EMT）5）转化为SCLC EGFR-TKI耐药机制：EGFR二次突变&其他致癌基因激活同时有EGFR扩增机制不明SCLC转化T790MSequist LV, et al. Sci Transl Med 2011; 3(75); Adapted from Sequist LV, et al. 2012 ASCO. cMET/ErbB3激活和过表达在EGFR-TKI 耐药过程中的作用•NSCLC (N=44)•EGFR-TKI治疗收集细针穿刺或胸腔积液样本评估EGFR和其他受体酪氨酸激酶 (RTKs 如ErbB2, ErbB3, cMET, IGF1R, ALK等)， 和下游AKT和MAPK通路蛋白的表达和激活研究目的：1) 根据RTKs和通路蛋白的表达/激活比较ORR2) 评价EGFR-TKI治疗期间RTK和通路蛋白的调节3) 在接受EGFR-TKI治疗的患者中，评估EGFR基因突变的激活和RTK激活的相关性RTK=络氨酸激酶E/M-指数>E/M-指数 (n)/
这些对用药都有极其重要意义•传统热点检测只能检测一种突变类型如点突变，往往漏掉许多重要信息•基因上下游综合信号通路分析也至关重要，如RAS-RAF-MEK-ERK及PI3K-AKT等NGS与肺癌EGFR专题30 31EGFR少见突变研究进展Unusual mutation of EGFREGFR基因常见激活突变21外显子L858R、19外显子非移码插入突变目前检测较多18‐21外显子其他敏感突变如G719Xaa、L861Q、S768I目前检测较少最新大样本研究结果显示，在3项肺癌临床实验600例肺癌患者中，12%（75/600）肺癌患者携带18‐21外显子少见突变（如G719Xaa、L861Q、S768I），并根据突变情况分成三组，给予阿法替尼给药治疗第一组：18‐21外显子少见点突变第二组：单独T790M突变或者T790M突变与其它突变共存第三组： EGFR基因20外显子插入突变分组Group1Group2Group3ORR71.1%14.3%8.7%MPFS10.7month2.9month2.7monthMOS19.4month14.9month9.2monthJames C-H Yang et al. Lancet oncology 2015 发现耐药机制 Reveal Drug Resistance耐药机制突变所占比例临床意义及治疗方案选择EGFR基因T790M突变50%一代EGFRTKI抗药，二代TKI如阿法替尼仍部分有效，三代针对此突变的TKI如AZD9291高度有效EGFR基因20外显子非移码插入突变4-9.2%一代、二代EGFRTKI均可能抗药ALK基因融合3%-7%ALKTKI如克唑替尼、色瑞替尼有效；一代EGFRTKI抗药ALK基因融合并携带特定点突变未统计一代ALKTKI如克唑替尼可能抗药；二代ALKTKI如色瑞替尼部分有效BRAF基因V600E激活突变1%-2%一代EGFRTKI抗药；BRAF抑制剂如威罗菲尼、达拉菲尼可能有效BRAF基因15外显子其他激活突变1%-4%一代EGFRTKI可能抗药HER2基因20外显子非移码插入突变2%-4%一代EGFRTKI可能抗药，二代TKI如阿法替尼仍有效HER2单抗如赫塞汀可能有效KRAS基因2、3、4外显子激活突变15%-25%一代EGFRTKI抗药；MEK抑制剂可能有效MEK1基因特定激活突变1%一代EGFRTKI抗药；MEK抑制剂可能有效MET/HGFR基因扩增5%-20%一代EGFRTKI抗药；MET抑制剂如克唑替尼可能有效NRAS基因2、3外显子激活突变1%一代EGFRTKI抗药；MEK抑制剂可能有效PIK3CA基因9、20外显子激活突变5%一代EGFRTKI抗药；MTOR抑制剂如伊维莫司可能有效PTEN基因截短失活突变如R233*4%-8%一代EGFRTKI抗药；MTOR抑制剂如伊维莫司可能有效ROS1基因融合2%ROS1TKI如克唑替尼有效；一代EGFRTKI可能抗药发现耐药机制实现个体化治疗，真正做到“对症下药耐药机制也是临床科研领域的热门领域，高分值科研成果32 2015年ASCO会议报道EGFR-TKIs新耐药机制332015年ASCO会议报道了肺癌两种驱动突变，同时也是EGFR-TKIs耐药机制：MET基因14外显子缺失和NF1基因失活突变突变MET基因14外显子缺失NF1基因失活突变突变解释MET基因14外显子缺失引起MET蛋白与c-CBL结合能力缺失，抑制c-CBL对MET的泛素化，抑制MET蛋白溶酶体降解途径，导致MET蛋白水平升高。
NF1基因介导KRAS-GTP向KRAS-GDP转化过程，NF1失活导致其对KRAS抑制活性缺失，KRAS持续激活下游信号通路用药相关EGFR-TKIs耐药MET抑制剂如克唑替尼可能有效EGFR-TKIs耐药MEK抑制剂可能有效突变特点全新的突变类型—剪切突变（常见突变类型包括拷贝数变化、碱基置换突变、缺失突变、插入突变、染色体断裂重排）无突变热点—抑癌基因失活(肿瘤中原癌基因突变主要集中在结构域、结合位点等热点位点，抑癌基因不存在突变热点，全基因各区域均可能发生失活突变)检测方法高通量测序或PCR方法高通量测序P. Paik et al. 2015 ASCO Abstract 8021；PA. Redig et al. 2015 ASCO Abstract 80222. 总结•随着研究的深入，我们不断发现新的肺癌驱动基因，不断完善肺癌的驱动基因谱，并研发新的靶向治疗药物•EGFR基因是突变概率最大、最多病人治疗获益的靶点，尤其是在亚裔患者，除了常见位点，携带少见EGFR突变，通过NGS检测出来仍然能通过靶向药物获益•由于原发或继发性耐药的发生，未来驱动基因的检测决不是一次性就可解决的问题，需要伴随治疗过程进行动态的检测•测序技术的不断发展优化是未来根据驱动基因选择靶点治疗的技术保证，是个体化治疗的基础 高通量测序技术的发展及研究报道高通量测序技术在肿瘤临床的应用 2目录Table of Contents35 精准医学时代的到来 肺癌精准医学是精确诊断与靶向治疗的结合精确诊断靶向治疗分子靶点药物EGFR吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、CO-1686,AZD9291ALK克唑替尼、AlectinibMetTivantinib(ARQ197),Onartuzumab(MetMab)Cabozantinib(XL184)FGFR1Nintedanib,XL999HER-2阿法替尼RET/ROS融合基因克唑替尼,AP26113,ASP3026RAS/MAPK通路Trametinib(GSK1120212)，Pimastertib，Refametinib,TAK733……PI3K/PTEN/AKTBEZ235,XL-765……PD-1/PDL-1Nivolumab,MPDL3280AHSP90…..Ganetespib 未来5年内靶向临床药物的选择将会有一个爆炸性的增长Explosive Growth for Targets Therapies Expected in Next 5 YearsFDA 统计于2012年38 肺癌临床药物及治疗Targeted Therapies in Lung Cancer39英文药名中文药名药敏基因备注Bevacizumab贝伐单抗VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3等--Erlotinib特罗凯EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等一代TKIGefitinib易瑞沙EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等一代TKIIcotinib埃克替尼EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等一代TKICetuximab西妥昔单抗EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等贵，T790M突变可用Crizotonib克唑替尼 EML4-ALK融合，ALK扩增，ROS1，MET等贵，一代ALK抑制剂肺癌靶向药物极多且选择逻辑复杂，目前在国内上市的肺癌药物有以下六种此外肺癌还有20款以上药物在国外上市或处于临床实验中，包括AZD9291、CO‐1686等 肺癌临床药物及治疗Targeted Therapies in Lung Cancer英文药名中文药名药敏基因备注Ramucirumab雷莫卢单抗VEGFR2贵，国外上市Afatinib阿法替尼EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等贵，国外上市但一代TKI耐药可用Nimotuzumab尼妥珠单抗EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等国外上市T790M耐药后可用Panitumumab帕妥珠单抗EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等国外上市T790M耐药后可用Ceritinib色瑞替尼 EML4-ALK融合，ALK扩增，ROS1，MET等国外上市克唑替尼耐药后可用Alectinib- EML4-ALK融合，ALK扩增，ROS1，MET等国外上市，脑转移可用克唑替尼耐药后可用AZD9291-EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等未上市T790M突变可用CO-1686- EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等未上市T790M突变可用AUY922-EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, PI3K,PTEN,MET,ALK, ROS1, ERBB2等未上市20外显子耐药插入可用肺癌靶向药物还有20款以上药物在国外上市或处于临床实验阶段，包括AZD9291、CO‐1686等40 目前靶向治疗现状 （I/IV） 癌种部分关联基因突变靶向药物EGFRExons 18‐21Erlotinib/gefitinib肺癌EML4‐‐‐ALKFusion productPF02341066 ALK/c‐Met inhibitor XRCC25 SNPsResponse to platinum agents ERCC1mRNA expression RRMImRNA expression 41现国内常见检测位点，一般为几个基因，几个位点 目前靶向治疗现状 （II/IV）42信号通路复杂性决定了：一代桑格测序采用的一个或几个基因检测不能准确的指导用药 目前靶向治疗现状 （III/IV）43•美国麻省综合医院现采用的癌症检测包括236个基因的全长测序•德州MD Anderson Cancer Center 正在研发的检测包括近400基因如果要准确进行个性化用药，我们需要了解癌症突变全景相关基因：包括信号通路上下游基因、同一基因家族基因等 目前靶向治疗现状 （IV/IV）44基因的突变类型多种多样，单位点检测漏掉大量信息突变类型现常用检测方法单碱基突变（KRASG12D）PCR+桑格测序小范围碱基缺失/插入（KITV559del）PCR+桑格测序大范围碱基缺失/插入（EGFR19外显子）ARMSPCR基因扩增/表达变化（ERBB2/HER2扩增）荧光定量PCR,FISH基因融合（EML4-ALK融合）FISH高通量测序可以一次检测上面列举的所有突变类型人类基因组结构变化示图：基因突变类型多种多样 通过临床新一代测序技术(NGS)揭示基因变异高检出率以指导肺癌的靶向治疗•386个肺癌FFPE标本，95%为NSCLC (367/386)•通过NGS为基础的诊断性检验方法来描绘基因变异图谱-检测182个癌症相关基因的3320个外显子-检测肿瘤中重排频率较高的14个基因的37个内含子结果：•确认1205个基因改变，平均每个肿瘤3.31个改变 (0-10)•85%(310) 标本包含1个可作为靶点的基因改变* ，平均每个标本1.79个 (0-6)•在68% (248)的肿瘤中，至少1个检测到的基因变异会被目前“热点”检测* *所遗漏Ali SM, et al. 2013 ASCO Abstract 8020.*可作为靶点的基因改变定义为具有相应的靶向抗肿瘤药物或能够在临床研究中加以评价的基因靶点改变* * 热点检测包括EGFR, KRAS 和EML4: ALK 等 通过临床新一代测序(NGS)揭示基因变异高发生率以指导肺癌的靶向治疗：结果GeneAlterations（percent）EGFR6.7ERBB21.3EGFR FamilyEstimated 8%STK1111PI3KCA10NF16AKT1/2/34PTEN4mTOR /PI3K pathwayEstimated 30%BRAF2c-KIT1PTCH1/SMO/SUFU1结论：•该研究发现了通过热点检测所无法检测到的一系列基因变异，可显著提高驱动基因的检出率，指导靶向治疗决策Ali SM, et al. 2013 ASCO Abstract 8020.actionable genomic alterations (GA) in lung cancer (LC) 基因检测改变了我们的临床实践 NGS临床应用病例介绍48 病史简介Case Studies•患者，男，68岁•2010-9-10检查胸部CT示：右肺上叶占位，右肺上叶类圆型小结节，大小约2.3×2.2cm，于外院全麻下行右肺叶切除术•术后病理示：腺癌。
乳头状及腺泡样混合亚型，中分化，侵脏层胸膜•基因检测：§EGFR：19号外显子，15bp碱基缺失；20号外显子，见同义突变Q787Q；18、21外显子未见突变§KRAS基因：2号外显子第12、13密码子均为野生型；3号外显子第61密码子为野生型49 治疗经过 （I/II）Treatment2010-10起予“培美曲塞+卡铂”方案辅助化疗4周期2011-03于华山医院予局部放疗2012-11至2013-05予CIK细胞治疗5次2013-08-07病情进展开始口服特罗凯，两肺结节明显变少变小2014-03-01、03-22予“培美曲塞” 化疗2周期因反应较大终止2014-06-03于101医院予生物治疗2014-08-27起予“培美曲塞+卡铂”方案化疗6周期2015-01-09予“培美曲塞” 化疗50 治疗经过（II/II）Treatment2015-03-23为进一步治疗入住我科，进行测序后使用AZD9291，目前病人情况良好二代高通量测序结果：EGFR基因：第21外显子N826S突变此突变为罕见突变，文献较少，但有病例报道过使用一代TKI抗药；二代如阿法替尼、三代如AZD9291或CO-1686可能有效51 52谢谢！ 。
