
酵母基因工程.pdf
26页1第15章酵母基因工程o酵母基因工程的发展o酵母表达系统o酿酒基因工程的应用15.1 酵母基因工程的发展o酵母菌是一类群体庞大的单细胞真核 微生物,种类繁多,至少包括80个属,600多种,10 000多菌株o酵母菌 有完整的亚细胞结构和严谨的基因表达调控机制,它既能通过有丝分裂进行无性繁殖,也可通过减数分裂实现有性繁殖名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页,共 26 页 -215.1.1 酵母基因工程的优点 是真核生物,大多具有较高的安全性;繁殖速度快,能大规模生产,具有降低基因工程产品成本的潜力;将原核生物中已知的分子和基因 操作技术与 真核生物中 复杂 的 转译后修饰 能力 相结合,能 方便地用于外源 基因的 操作;采用 高表达 启动子,可高 效表达 目的基因,而且可诱导 调控;提供了 翻译后加 工和分 泌的环境,使得 产物 与天然蛋白 一样或 类似;酵母菌可将表达的外源蛋白与末端前导肽融合,指导新 生肽分泌,同时在 分泌过程中可 对表达的 蛋白进行 糖基化修饰;不会形 成不溶 性的 包涵体,易于 分离提纯;移去起始甲硫氨酸,避免了在作为药物使用 中引起免疫反应 的问题;酵母菌(主要 是酿酒 酵母)已完成 全基因 组测序,它具有 比大肠杆 菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的 加工修饰 及分泌能力;酵母可进行 蛋白 的N-乙酰 化、C-甲基化,对定向到膜的胞 内表达 蛋白 具有 重要作用。
名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页,共 26 页 -315.1.2 发展现状o在酵母基因工程中发展 和应用 较多的酵母:酿酒 酵母乳酸克鲁维 酵母(Kluyveromyceslactis)巴斯德毕赤 酵母(Pichiapastoris)多形汉逊 酵母(Hansenulapolymorpha)烷烃利 用型降脂耶氏 酵母(Yarrowialipolytica)粟酒 裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)o应用:改造 酵母本 身用以提高发酵性能和 表达异源蛋白 两方面1酿酒酵母自身的改造将葡萄 糖淀粉酶 基因 导入酿酒 酵母,水解 多糖 将外源 的蛋白 水解酶 基因 导入酿酒 酵母,水解麦汁 中蛋白 将-葡聚 糖酶基因 导入酵母,水解-葡聚糖 将ATP 硫酸化 酶和腺苷酰 硫酸 激酶 基因 在酿酒酵母体 内表达,促进SO2产生 将人血清清 蛋白(HAS)的基因 转化 到酿酒 酵母名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页,共 26 页 -42酵母表达异源蛋白 表达 水平o酵母的高 效表达:通过 开发 高效的启动子 提高和控制 外源 基因的 转录水平;提高表达 载体在细胞中的 稳定 性;通过多 次同源 重组以及介 导的整 合两种方式 提高表达基因 在细胞中的 拷贝数。
表达 质量o提高酵母的 遗传稳定 性o根据 表达 蛋白 的 不同,选用不同 的酵母 宿主15.1.3 发展趋势1解决 酵母基因工程中还存在的缺陷2在人类基因 组 计划 中的 应用 研究是一个 重要的发展 方向3利用酵母基因工程筛选更多的 新药4改造酿酒 酵母 自身,降低生产 酒精的成本5酵母的生 理承受极限研究将引起人们的关注名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页,共 26 页 -515.2 酵母表达系统15.2.1 酵母表达载体典型的酵母表达 载体均为大肠杆 菌和酵母菌的穿梭质粒o原核 部分:大肠杆 菌中 ori 和抗生素抗 性序列o酵母 部分:维持复制的 元件,如附 加型的2m 质粒复制起点序列,或染色 体的 自主复 制序列(auto-replication sequence,ARS),或整合型载 体的 整合介导区;酵母 转化子 的筛选组 分以及编码特 定蛋白 的基因 启动子 和终止 子序列o分泌型表达 载体还要带有信号 肽序列(2)载体的复制形式 附加型载 体o在酵母 宿主中的 拷贝 数量大,但在传代过程中易丢失,影响 重组 菌的 稳定 性和表达 量o两类:(1)利 用酿酒 酵母 2m 质粒的DNA 复制有 关的元件所 构建,这类载体转化效 率很 高,每gDNA 可得103-104个转化子;(2)利 用酵母基因 组DNA 的自主复 制序列,能在酵母 染色 体外自主复 制。
名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页,共 26 页 -6 整合型载体o整合在 酵母细胞 染色 体基因 组DNA 上,稳定 性高,但拷贝 数量低o不含酵母的 复制 起始 区,而是含与受体菌株基因组有某种程度 同源 性的一段DNA 序列,能有 效介导载体与宿主 染色 体之间发生同源 重组,使载体整 合到宿 主 染色 体上并随 同酵母 染色 体一起复 制外源基因整 合靶位点 酵母rDNA 单元o 酵母rDNA 单元大小为9.1kb,每个单元包含有35S rRNA 前体和5S rRNA基因,这两个转录单元之间 有非翻译区(NTS),在非翻译区含有DNA 复制原点,如图15-1所示o 在rDNA 单元中有两个HOT 区(激活rDNA 间的重组)和一个 TOP 区(抑制rDNA 间的重组)o 如果所取rDNA 片段只 有HOT 区,就容易发生重组,整合拷贝就容易丢失o 如果所取的rDNA 片段既有HOT 区,又有TOP区,或者两者都不存在,整合拷贝间就不容易重组,整合拷贝就很稳定名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页,共 26 页 -7图15-1 酵母 rDNA单元结构示意图ARS:an autonomous replicating sequenceRFB:a replication fork barrierNTS:non-transcribed regions18S5.8S25SNTS1NTS2RFB5SARS35S2宿主o作为 酵母表达 系统 的宿主应 具备以 下条件:安全无 毒,不 致病 遗传 背景 清楚,容易进行遗传 操作 构建的 载体DNA 容易进入,转化 频率 较高 发酵周期短,培养条件 简单,容易进行高 密度发酵 蛋白 质 分泌能力 良好 有类 似 高等真核生物的 蛋白 质翻译后 的修饰 功能名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 7 页,共 26 页 -83酵母的 DNA 转化 原生 质体法 转化效 率不稳定,转化时 间长、成本较高。
离子溶 液法将酵母细胞 用各种离子(如Cs、Li)溶液进行 处理,然后 进行 DNA 转化,能 明显增 加外源DNA 的吸入优点是操作 简便、易掌握PEG1000 法 通过 PEG 处理酵母细胞 获得类感受态再转化电穿孔法 和粒子轰击法(particle bombardment或biolistics)优点是转化效 率最高,常用于 一些新的酵母 宿主细胞的 DNA 转化缺点 是需要特殊的设备、成本较高,所以不是常规的 转化方 法4酵母分 泌外源蛋白 的糖基化o不同 酵母细胞 对分泌蛋白 的糖基化方 式和程度不同,加到分泌蛋白 上的碳水化合 物的 长度和结构是 由酵母本 身决定 的o酿酒 酵母 分泌的糖蛋白 大多数是 过度 糖基化(40个甘露 糖残基)o巴斯德毕赤 酵母 分泌的糖蛋白 的寡糖链8-14 个甘露 糖名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 8 页,共 26 页 -915.2.2 常用酵母表达 系统1酿酒 酵母表达 系统o酿酒 酵母 很早就被应用于 食品和 饮料 工业,是发酵工 业中的 主要 生产菌株,是 人们最先建立的酵母表达 系统o已发展 和建立的酿酒 酵母表达 载体:附加型和整合型。
附加型表达载体o多为大肠杆 菌-酿酒 酵母 穿梭 表达 质粒o酵母 部分:酵母菌的 2m 质粒的复制区o选择元件:营养 缺陷 型相关的基因 如LEU2、HIS4和URA3 基因o表达 盒式结构:启动子:乙 醇脱氢 酶启动子 PADH1、半乳糖诱导型启动子 PGAL;分泌信号:酿酒 酵母 自身-交配 因子的分 泌信号;终止 子:CYC1 基因的 转录终止 子名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 9 页,共 26 页 -10图15-2 酿酒酵母附加型表达载体图15-2:酿酒酵母利用2m 质粒复制区的自主复制型表达载体(1)pYES2:不带信号 肽序列可在胞内或胞外表达(2)pHBM363:带有信号肽的分泌表达载体 整合型表达载体o没有在酵母中 复 制的 质粒复制区,利用同源 片段将载体整 合到 染色 体上o与附加型载 体一 样,该类载体也有 用于 酵母 转化的选择元件 和原核生物 部分的 复制起始 序列以及 某种抗性基因名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 10 页,共 26 页 -11图15-3 酿酒酵母 rDNA介导的整合型分泌表达载体启动子类型诱导 型oPGAL在半乳糖存在的条件下 表达 水平 提高 1 000倍,诱导 表达 GAL1、GAL7 及GAL10 基因产物 占细胞总蛋白 的0.5%-1.5%,是 常用的启动子。
组成型o用Kex2酶切去由 重组 蛋白与 酵母-交配 因子的前导 序列融合 的 部分提高拷贝 数:用酵母 转座子以产生多个 插入拷贝;通过 rDNA介导的重组 插入到 核糖体DNA 簇中在宿主染色 体上以 约150个串联 重复序列存在名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 11 页,共 26 页 -12酿酒酵母不足之处o较难进行高 密度发酵:乙醇的产生和 影响o蛋白 质的分 泌能力较 差o过度 糖基化修饰,平均50-150个甘露 糖残基2巴斯德毕赤 酵母表达 系统o甲醇营养 型酵母(methylotrophicyeast,简称甲醇酵母)是能 在以甲醇为唯一碳源和能 源的培养基上生长的酵母,涵盖假 丝酵母、汉逊酵母、毕赤 酵母和 球拟 酵母 4个属名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 12 页,共 26 页 -13甲醇酵母表达 系统优点:启动子 强,且受甲醇严格诱导,因 此可用于 调控外源蛋白 的表达作为 真核表达 系统,能 对重组 蛋白 进行 翻译后 必要的剪接、折叠 和修饰,糖基化也更接近 高等真核生物操作 简单易行,但外源蛋白 的表达 量却比酿酒 酵母增加了 10-100 倍。
重组 菌的 遗传 性质稳定,表达 量和分 泌效 率高,适于大规模 发酵高密度培养干 细胞 量可达 100g/L 以上巴斯德毕赤 酵母生物 学特点o甲醇代谢所需的醇氧 化酶被分选到 过氧化物酶体中,形成区域化o以葡萄 糖作碳源时,菌体中 只有1个或很少几个小的过 氧化物酶体;o以甲醇作碳源时,过氧化物酶体几乎 占到整个细胞体 积的80%,醇氧 化酶AOX 增至细胞 总蛋白的35%-40%名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 13 页,共 26 页 -14巴斯德毕赤酵母o一种表达 宿主,以甲醇作为唯一的能 源和碳源o甲醇能够迅 速诱导 其合成大量的乙醇氧 化酶(alcohol oxidase,AOX)o在巴斯德毕赤 酵母中有 两个基因(AOX1 与AOX2)编码 AOX,约占 全部可溶性蛋白 质的30%以上,基因严 格地受甲 醇的诱导 和调控o乙醇氧 化酶(alcohol oxidase,AOX)oAOX1 基因 与AOX2 基因 序列相似,有 92%的同源 性,其编码 蛋白 有97%的同源 性,但AOX1 基因的 编码 产物在氧化过程 起主要作用.o甲醇能诱导 AOX 的合成,而甘油和葡萄 糖则抑制AOX的产生。
o当细胞 以葡萄 糖、甘油、乙醇为碳源生长时不能检测到 AOX1 的活性,而在甲 醇培养的细胞中,该酶可大量产生o表达 载体大多是 利用AOX1 启动子 的强诱导 性使它下游的外源 基因 易于 调控,并具有 很高的表达 量名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 14 页,共 26 页 -15巴斯德毕赤 酵母 优点o强的乙醇氧 化酶基因 AOX1 启动子o表达的 蛋白 质具。












