实验35过氧化氢酶的活性测定.docx

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使h2o2发生累积h2o2可以直接 或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰 老和解体过氧化氢酶可以清除h2o2,是植物体内重要的酶促防御系统之一因此，植物 组织中h2o2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关本实验用分光光度法测定过 氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性―、过氧化氢含量的测定【原理】h2o2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物一钛复合物黄色沉淀，可被h^o4溶解后， 在415nm波长下比色测定在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系仪器和用具】研钵；移液管0.2mlX2支，5mlX 1支；容量瓶10mlX7个，离心管5mlX8支；离心机； 分光光度计试剂】100 U mol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57 U l,溶于100ml,再稀释100倍；2mol/L 硫酸；5% （W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水方法】1. 制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂表40-1测定H°O°浓度标准曲线配置表试剂（ml）离心管号1234567100 U mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04°C下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min 离心 10min,弃去上清夜，留沉淀2mol硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管， 将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。

2样品提取和测定:（1）称取新鲜植物组织2〜5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取 剂1 : 1的比例加入4p下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离 心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液2）用移液管吸取样品提取液1ml,按表35-1 加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液沉淀用丙酮 反复洗涤3〜5次，直到去除植物色素3）向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解 后，与标准曲线同样的方法定容并比色3. 结果计算：植物组织中H2O2含量（u mol/g Fw）=式中C一标准曲线上查得样品中H2O2浓度（umol）；Vt一样品提取液总体积（ml）；V1—测定时用样品提取液体积（ml）；FW一植物组织鲜重（g）二、过氧化氢酶的活性测定 高锰酸钾滴定法【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH-)R（Fe+3OH-）2+H2O2==R（Fe+2）2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或o2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定 量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定 多余的h2o25HO,+2KMnO4+4H,SO4 — 5O+2KHSO+8HO+2MnSO,即可求出消耗的h2o 2的量仪器和用具】研钵；三角瓶50mlX4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25mlX1试剂】10% H2SO4； 0.2mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4 （AR） 3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L HO:市售30% HO大约等于 17.6mol/L，取30% HO溶液5.68ml，稀释至 1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 - 2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L方法】1. 酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2. 取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮 死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30°C恒温水浴中保温10min，立即 加入 10% H2SO4 2.5ml3. 用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点4. 结果计算：酶活性用每克鲜重样品1 min内分解H2O2的毫克数表示：酶活（mgH2O2/gFW • min）=式中 A一对照KMnO4滴定毫升数；B一酶反应后KMnO4滴定毫升数；VT一酶液总量（ml）；V1—反应所用酶液量（ml）;W一样品鲜重（g）；1.7—1ml 0.1mol/L 的 KMnO4相当于 1.7mg H2O2O【注意】所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定三、过氧化氢酶的活性测定一一紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240） 随反应时间而降低根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸 管1支；10ml试管3支；恒温水浴；【试剂】0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯毗咯烷酮）；0.1mol/L H2O2 （用0.1mol/L 高锰酸钾标定）。

方法】1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2〜3ml 4°C下预冷 的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵 数次，合并冲洗液，并定容到刻度混合均匀将量瓶置5C冰箱中静置10min，取上部澄清 液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液5C下保存备用2. 测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试 剂表40-2紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号S1S2S3粗酶液（ml）0.20.20.2pH7.8 磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水（ml）1.01.01.025C预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比 色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按 下式计算酶活性3. 结果计算：以1 min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）过氧化氢酶活性（u/gFW/min）=式中 A240= as一人踞一加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, A^一样品管吸光值；Vt一粗酶提取液总体积（ml）；V］一测定用粗酶液体积（ml）；FW一样品鲜重（g）；0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t一加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

注意事项】凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰思考题】1. 影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？2. 过氧化氢酶与哪些生化过程有关？。