液相色谱分析.ppt

高效液相色谱高效液相色谱•概述概述 •HPLC HPLC 理论基础理论基础 •HPLC HPLC 主要类型主要类型 •HPLC HPLC 仪器仪器 •HPLC HPLC 应用应用 第一节第一节 概述概述•高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法一、一、一、一、HPLCHPLCHPLCHPLC与经典与经典与经典与经典LCLCLCLC区别区别区别区别二、二、二、二、HPLCHPLCHPLCHPLC与与与与GCGCGCGC差别差别差别差别三、特点及应用三、特点及应用三、特点及应用三、特点及应用一、一、HPLCHPLC与经典与经典LCLC区别区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1 1．经典．经典LCLC：仅做为一种：仅做为一种分离手段分离手段• 柱内径柱内径1 1－－3cm3cm，固定相粒径，固定相粒径>100μm >100μm 且不均匀且不均匀• 重力加料重力加料输送流动相输送流动相 • 柱效低（柱效低（H↑H↑，，n↓n↓）。

• 分析周期长分析周期长• 无法检测无法检测2 2．．HPLCHPLC：：分离和分析分离和分析• 柱内径柱内径2-6mm2-6mm，，固定相粒径固定相粒径<10μm<10μm（球形，匀浆装柱）（球形，匀浆装柱） • 高压输送流动相高压输送流动相• 柱效高（柱效高（H↓H↓，，n↑n↑）• 分析时间大大缩短分析时间大大缩短 • 可以检测可以检测二、二、HPLCHPLC与与GCGC差别差别•相同：兼具相同：兼具分离和分析分离和分析功能，均可以功能，均可以检测 •主要差别：主要差别：分析对象分析对象的差别和的差别和流动相流动相的差别1 1 1 1．分析对象：．分析对象：．分析对象：．分析对象： GCGCGCGC：：：： 能能能能气化气化气化气化、、、、热稳定性好热稳定性好热稳定性好热稳定性好、且、且、且、且沸点较低的样品沸点较低的样品沸点较低的样品沸点较低的样品; ; ; ; 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测；占高聚物的样品不可检测；占高聚物的样品不可检测；占高聚物的样品不可检测；占有机物的有机物的有机物的有机物的20%20%20%20%。

HPLCHPLCHPLCHPLC：：：： 溶解后能制成溶液的样品，溶解后能制成溶液的样品， 不受样品不受样品挥发性和热稳定性挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及分子量大、难气化、热稳定性差及高分子高分子 和离子型样品和离子型样品均可检测；占均可检测；占有机物的有机物的80%80%2 2．流动相差别：．流动相差别： GCGC：流动相为惰性气体流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用只与固定相作用 HPLCHPLC：流动相为液体流动相为液体 流流动动相相与与组组分分间间有有亲亲合合作作用用力力，，为为提提高高柱柱的的选选择择性性、、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用改善分离度增加了因素，对分离起很大作用Ø流动相流动相极性和极性和pHpH值值的选择也对分离起到重要作用的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相。

选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性3 3．操作条件差别：．操作条件差别： GCGC：： 加温操作加温操作 HPLCHPLC：：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、三、HPLCHPLC的特点和应用的特点和应用•““三高三高” “” “一快一快” “” “一广一广””n高柱效高柱效——n=10n=104 4片片/ /米，柱效高（远高于一般米，柱效高（远高于一般LCLC））n高灵敏度高灵敏度n高选择性高选择性n分析速度快分析速度快n应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%80%有机化合物）有机化合物）第二节第二节 基本理论基本理论热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论————平衡理论基础平衡理论基础平衡理论基础平衡理论基础动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论————VanderVanderVanderVander方程方程方程方程 一、塔板理论一、塔板理论一、塔板理论一、塔板理论二二 速率理论速率理论•GC: H=A+B/U+CU(GC: H=A+B/U+CU(填充柱填充柱) ) H=B/U+CU( H=B/U+CU(毛细管柱毛细管柱) ) HPLC: H=A+CU HPLC: H=A+CUB=2γDB=2γD, ,对于对于HPLCHPLC，因，因DmDm较小，较小， B B项可忽略项可忽略 三、三、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择1. 1. 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选选粒径小粒径小的、的、分布均匀分布均匀的球形固定（的球形固定（dp≤10μmdp≤10μm）。

首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2. 2. 流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择： 选选粘度小粘度小、、低流速低流速的流动相的流动相 3. 3. 柱温的选择：柱温的选择： 选选室温室温25250 0C C左右左右液相色谱仪：液相色谱仪：p高压输液系统高压输液系统p进样系统进样系统p分离系统分离系统p检测系统检测系统p记录系统记录系统第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪工作过程图工作过程图仪器构造图仪器构造图1 1高压输液系统高压输液系统•高压泵高压泵 对泵的要求对泵的要求：：输出压力高、流量范围大、流量恒定、输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为无脉动，流量精度和重复性为0.5%0.5%左右还应耐腐蚀，左右还应耐腐蚀，密封性好密封性好 恒流泵恒流泵是能给出是能给出恒定流量恒定流量的泵，其流量与流动相粘的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充度和柱渗透无关可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。

现已较少使用 恒压泵恒压泵是保持输出是保持输出压力恒定压力恒定，而流量随外界阻力变，而流量随外界阻力变化而变化有化而变化有机械注射式机械注射式和和机械往复式机械往复式两种每分两种每分钟往复钟往复2525~100100次，脉动小对流量变化敏感的检测次，脉动小对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器 •脱气装置脱气装置 脱气装置用于脱去流动相中的脱气装置用于脱去流动相中的溶解溶解气体气体，流动相先经过脱气装置再输送到色，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱，脱气不好时有气泡，导致谱柱，脱气不好时有气泡，导致流动相流流动相流速不稳定，造成基线飘溢，噪音增加速不稳定，造成基线飘溢，噪音增加, ,也可也可采用采用超声脱气和真空脱气超声脱气和真空脱气 AA•梯度淋洗装置梯度淋洗装置 在分离过程中通过不断地变化流动相的在分离过程中通过不断地变化流动相的强度强度( (极极性、性、pHpH值或离子强度值或离子强度 ) )，来调整混合样品中各组分的，来调整混合样品中各组分的k k值值，使所有谱带都以，使所有谱带都以最佳平均最佳平均k k值值通过色谱柱。

通过色谱柱 BCBC C2 2．进样装置．进样装置 •1 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样隔膜注射进样：使用微量注射器进样装装置简单、死体积小置简单、死体积小但但进样量小且重现性差进样量小且重现性差•2 2）高压进样阀：目前最常用的为）高压进样阀：目前最常用的为六通阀六通阀由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重重复性好3 3．色谱柱．色谱柱 一一般般直直径径2 2－－6mm6mm, ,柱柱长长1010－－30cm30cm, , ( (尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱柱柱常常大大于于5mm5mm；；制制备备色色谱谱柱柱内内径径更更大大，，可达可达25mm25mm以上以上) )4 4．检测器．检测器 1 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2 2））示示差差折折光光检检测测器器：：利利用用折折光光率率的的差差别别，， 灵敏度低，温度要求严格。

灵敏度低，温度要求严格 3 3））荧荧光光检检测测器器：：只只能能分分析析自自身身发发光光的的物物质质，， 灵敏度高灵敏度高 4 4）电化学检测器电化学检测器 5 5）其它检测器：）其它检测器：MSMS、、IRIR、光散射、极谱光散射、极谱  紫外检测器紫外检测器•其检测原理采用的吸收池为其检测原理采用的吸收池为微微量吸收池量吸收池，通常其光程为，通常其光程为2-2-10mm10mm，体积约为，体积约为1~10  L L• HPLC HPLC分析中，约有分析中，约有80%80%的物质的物质可以在可以在254nm254nm或或280nm280nm处产生紫处产生紫外吸收•在选择测量波长时注意：溶剂在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低所选波长不能小于溶剂的最低使用波长使用波长 示差折光检测器：示差折光检测器：•原理：利用原理：利用两束相同角度的光两束相同角度的光照射照射溶剂相溶剂相和和样样品品+ +溶剂相溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品一束（通常是通过样品+ +溶剂相）光因为发生偏溶剂相）光因为发生偏转造成转造成两束光的强度差发生变化两束光的强度差发生变化，将此差示信，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。

号放大并记录，该信号代表样品的浓度•为通用型检测器，灵敏度为为通用型检测器，灵敏度为1010-7-7g/mLg/mL但对温度变化敏感，且度变化敏感，且不适于梯度淋洗不适于梯度淋洗 荧光检测器荧光检测器• 许多有机物具许多有机物具荧光活性荧光活性，尤其是芳，尤其是芳香族化合物香族化合物具有很具有很强的强的荧光荧光活性荧光检测器是一种选择性很强的检测器，活性荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比其灵敏度比UVUV检测器高检测器高2~3个数量级个数量级 电导检测器电导检测器• 电导检测器主要用于电导检测器主要用于离子色谱离子色谱的检测的检测• 其原理是基于其原理是基于待测物待测物在一些介质中电离后所产生的在一些介质中电离后所产生的电电导（电阻的倒数）变化导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量电导检来测量电离物质的含量电导检测器的主要部件是测器的主要部件是电导池电导池其响应受温度影响较大，因其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中另外，此需要将电导池置于恒温箱中另外，当当pH>7pH>7时，该检时，该检测器不够灵敏测器不够灵敏第四节第四节 HPLCHPLC流动相和固定相简介流动相和固定相简介一、流动相一、流动相理想的溶剂应有下列特性：理想的溶剂应有下列特性：1 1）避免使用引起柱效损失或保留特性变化的试剂。

避免使用引起柱效损失或保留特性变化的试剂2 2）与检测器相匹配与检测器相匹配3 3）高纯度：否则基线不稳或产生杂峰高纯度：否则基线不稳或产生杂峰4 4）化学稳定性好化学稳定性好5 5）适宜的粘度：粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡适宜的粘度：粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡二、固定相载体二、固定相载体 由于各种由于各种HPLCHPLC分离方法的流动相均为液体，因此，分离方法的流动相均为液体，因此，HPLCHPLC通常通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的是按照固定相载体或固定液的不同来分类的1. 1. 按承受压力分：按承受压力分：•刚性固体刚性固体：：SiOSiO2 2为基质，耐压为为基质，耐压为7.0×108~1.0×109 Pa可制成直可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合吸附、分配和键合色谱•硬硬 胶胶：以聚合物为基质：以聚合物为基质( (常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成) )，，耐压上限为耐压上限为3.5×103.5×108 8 Pa Pa, , 主要用于主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。

离子交换和尺寸排阻色谱2. 2. 按孔隙深度分：按孔隙深度分：•表面多孔型表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔多孔活性材料活性材料( (如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等) )表面多孔型固定相的表面多孔型固定相的颗粒大颗粒大( (易装柱易装柱) )、多孔层厚度小且孔浅、多孔层厚度小且孔浅( (渗渗透性好，出峰快透性好，出峰快) )；但交换容量小适于；但交换容量小适于常规分离常规分离分析•全多孔型全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，颗粒极细，因而孔径小、传快、因而孔径小、传快、 柱效高柱效高特别适于特别适于复杂混合物的分离复杂混合物的分离第四节第四节 HPLCHPLC主要类型主要类型 一、吸附色谱一、吸附色谱（（adsorption chromatographyadsorption chromatography））•原理原理：基于被测组分在固定相表面具有：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用吸附作用，，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。

保留和实现分离•固定相固定相：： 固定相通常是固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺炭、聚乙烯、聚酰胺等等固体吸附剂固体吸附剂，所以吸附色谱，所以吸附色谱也称液固吸附色谱活性硅胶最常用也称液固吸附色谱活性硅胶最常用流动相流动相：： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷庚烷等）、二氯甲烷/ /甲醇、乙酸乙酯甲醇、乙酸乙酯/ /乙腈等乙腈等 应用应用：： 吸附色谱用于吸附色谱用于结构异构体分离和族分结构异构体分离和族分离离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离缺点是容易产生不油中烷、烯、芳烃的分离缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象对称峰和拖尾现象 二、分配色谱二、分配色谱•原理原理：： 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶溶解度不同解度不同，因而具有不同的分配系数因而具有不同的分配系数•流动相流动相: :HPLCHPLC分析中，为防止固定相的流失，流动分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差二者的极性相差越大越好。

越大越好 根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为液色谱分为正相分配色谱正相分配色谱（流动相极性小于固定相（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反反相分配色谱相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）的先流出，适于非极性组分分离）固定相固定相•原则上，用于原则上，用于GCGC的固定相也可用于的固定相也可用于HPLCHPLC作固定相但作固定相但HPLCHPLC固定固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为： ，， ’’- -氧二丙腈氧二丙腈(ODPN)(ODPN)、聚乙二醇、聚乙二醇(PEM)(PEM)、十八烷、十八烷(C18)(C18)、角鲨烷、角鲨烷(SQ)(SQ)• 根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛合型，后者应用更为广泛。

•1 1））机械涂渍固定相机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型面多孔型( (0.5-1.5%0.5-1.5%涂布量涂布量) )或全多孔型载体或全多孔型载体( (5-10%5-10%涂布量涂布量) )上上形成的液液色谱固定相该种固定相最大的不足形成的液液色谱固定相该种固定相最大的不足是固定液易流是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗 为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱前置柱，该，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和析柱之前，预先被固定液饱和 2 2））化学键合固定相化学键合固定相• 化学键合固定相是通过化学反应将化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在有机分子键合在载体表面载体表面所形成的柱填充剂，存在着所形成的柱填充剂，存在着双重分离机制双重分离机制：：( (键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理),),高覆盖率：分配为高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主主；低覆盖率：吸附为主；特点如下：；特点如下： 传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快 寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击 耐水、耐光、耐有机溶剂。

耐水、耐光、耐有机溶剂 选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性，可键合不同官能团，提高选择性, ,有利于有利于梯度洗脱梯度洗脱Si-O-RSi-O-R：：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相因此只适于以不含水或醇的流动相Si-R(Si-R(或或Si-N)Si-N)：：不水解，热稳定性比硅酸脂好使用水溶液作流不水解，热稳定性比硅酸脂好使用水溶液作流动相时，其动相时，其pHpH应在应在4-84-8之间Si-O-Si-RSi-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在：不水解，热稳定性好，在pH2-8pH2-8范围内对水稳定范围内对水稳定应用应用：液液色谱是基于化合物中：液液色谱是基于化合物中取代基的数目或性质不同取代基的数目或性质不同，或，或化合物的相对分子量不同达到分离的能分析各种化合物的相对分子量不同达到分离的能分析各种不同性质的不同性质的样品，无论极性化合物还是非极性化合物样品，无论极性化合物还是非极性化合物可见：反相键合色谱中，可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长（极性越小），分离效键合相碳链越长（极性越小），分离效果越好果越好 三、离子交换色谱三、离子交换色谱•1 1 原理原理：利用：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别力）的差别来实现分离的。

来实现分离的 •应用应用：适用：适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子因此，应用范围较广如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子因此，应用范围较广 2 2 固定相固定相：作为固定相的离子交换剂，其基质大致有：作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分再根据官能基离子交换剂又有阳离子和阴离子之分再根据官能基的离解度大小还有强弱之分的离解度大小还有强弱之分常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种： 多多孔孔型型离离子子交交换换树树脂脂：：它它主主要要是是聚聚苯苯乙乙烯烯和和二二乙乙烯烯苯苯基基的的交交联聚合物，直径约为联聚合物，直径约为5 5～～20μm20μm，有微孔型和大孔型之分，有微孔型和大孔型之分 薄薄膜膜型型离离子子交交换换树树脂脂：：它它是是在在直直径径约约对对30μm30μm的的固固体体惰惰性性核核上上，，凝聚凝聚1 1～～2μm2μm厚的厚的树脂层。

树脂层 表表面面多多孔孔型型离离子子交交换换树树脂脂：：它它是是在在固固体体惰惰性性核核上上，，覆覆盖盖一一层层微球硅胶微球硅胶，再在上面涂一层很薄的，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂离子交换树脂 •离子交换键合固定相离子交换键合固定相：：它是用化学反应将离子交它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面换基团键合到惰性载体表面•它也分为两种类型一种是它也分为两种类型一种是键合薄壳型键合薄壳型，其载体，其载体是是薄壳玻珠薄壳玻珠另一种是另一种是键合微粒载体键合微粒载体型，它的载型，它的载体是体是多孔微粒硅胶多孔微粒硅胶后者是一种优良的离子交换后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压度固定相和高柱压来实现来实现快速分离快速分离 3 3 流动相流动相•pHpH值值：影响：影响酸或碱的离解平衡酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数控制组分离子形式所占的分数当组分以分子形式存在时，则不被保留；当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留离子分数越高，保留值越大值越大。

常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等•离子强度离子强度I I：：对保留值的影响比对保留值的影响比pHpH更大组分保留值受流动相中更大组分保留值受流动相中盐类总浓度控制盐类总浓度控制增加外加阴或阳离子将降低增加外加阴或阳离子将降低样品离子的竞争样品离子的竞争吸附能力吸附能力，使组分保留值减小，使组分保留值减小通过加入不同种类的盐，可影通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同•有机溶剂有机溶剂：：外加有机溶剂通常减小组分的保留值其极性越小，外加有机溶剂通常减小组分的保留值其极性越小，保留值越小保留值越小常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等•配离子配离子L L：当大量：当大量L L、组分、组分X X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+XRM-L+X RM-X+L RM-X+L，，该法用于该法用于分离各种氨基酸或碱类分离各种氨基酸或碱类四、离子色谱四、离子色谱 • 离子色谱离子色谱( (ICIC) )是是7070年代发展的新方法。

其分离原理与年代发展的新方法其分离原理与离离子交换色谱原理子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用一样，只是流出的各种离子用电导检测电导检测器器检测但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测检测但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高离子约高2 2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号离子信号•为解决此问题，为解决此问题，19751975年年Small Small 提出，在离子交换柱之后，提出，在离子交换柱之后，再串结一根再串结一根抑制柱抑制柱该柱装填与分离柱电荷完全相反的该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使离子交换树脂通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，，从而可用电导检测器检测各种离子的含量从而可用电导检测器检测各种离子的含量•例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：•R R+ +—OH + —OH + HClHCl( (流动相流动相)——)——R+—R+—ClCl- - + + H H2 2O O•R R+ +—OH + —OH + MClMCl( (待测物待测物) ——) ——R R+ +——ClCl + + M M+ +OHOH- -•由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了导很小的水，消除了流动相本底电导流动相本底电导的影响。

同时，的影响同时，又将样品阳离子又将样品阳离子M M+ +转变成相应的碱，由于转变成相应的碱，由于OHOH- -离子的淌离子的淌度为度为ClCl- -离子的离子的2.62.6倍，倍，提高了所测阳离子电导的检测提高了所测阳离子电导的检测灵敏度灵敏度对于阴离子样品也有相似的作用机理对于阴离子样品也有相似的作用机理• 该法的该法的不足之处在不足之处在于：于：抑制柱要定期再生抑制柱要定期再生、谱、谱峰在经过抑制柱后会展峰在经过抑制柱后会展宽，宽，降低分离度降低分离度• 因此有人提出了使用因此有人提出了使用电导率很低的溶液电导率很低的溶液( (如苯如苯甲酸盐稀溶液甲酸盐稀溶液) )作流动相作流动相称为称为非抑制型离子色谱非抑制型离子色谱或单柱离子色谱或单柱离子色谱五、离子对色谱五、离子对色谱•离子对色谱离子对色谱主要用来分离主要用来分离强极性有机酸和有机碱强极性有机酸和有机碱•原理原理: :离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称荷相反的离子（称对离子或反离子对离子或反离子）加到流动相或固定）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成相中，使其与溶质离子结合形成离子对离子对，从而控制溶质，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法离子保留行为的一种色谱法 例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子动相中加入与待测离子A A- -有相反电荷的离子有相反电荷的离子B B+ +：： 由于离子对由于离子对ABAB具有疏水性，因而被非极性固定相提具有疏水性，因而被非极性固定相提取。

其它待测离子取其它待测离子A1A1，，A2A2，，A3……..A3……..因与因与B B离子间的成离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的•阴离子分离阴离子分离：常采用：常采用烷基铵类烷基铵类，如，如氢氧化四丁氢氧化四丁基铵基铵或或氢氧化十六烷基三甲铵氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子作为对离子•阳离子分离阳离子分离：常采用：常采用烷基磺酸烷基磺酸类，如己烷磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子钠作为对离子•反相离子对色谱反相离子对色谱：非极性的疏水固定相：非极性的疏水固定相(C-18(C-18柱柱) )，含有对离子，含有对离子Y Y+ +的甲醇的甲醇- -水或乙腈水或乙腈- -水作为流水作为流动相，试样离子动相，试样离子X-X-进入流动相后，生成疏水性进入流动相后，生成疏水性离子对离子对Y Y+ +X X- -后；在两相间分配后；在两相间分配六、尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法•尺寸排阻色谱法又称尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱凝胶色谱法，主要用于法，主要用于较大分子较大分子的分离。

与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸的分离与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的基于试样分子的尺寸和形状尺寸和形状不同来实现分离的不同来实现分离的•分离原理分离原理：固定相为化学惰性的：固定相为化学惰性的多孔凝胶多孔凝胶，它类似于，它类似于分子筛，但孔径更大凝胶内有一定大小的空穴，分分子筛，但孔径更大凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱即待测物分子按分子大小最后流出色谱柱即待测物分子按分子大小( (分子量大分子量大小小) )先后从柱中流出先后从柱中流出  尺寸排阻色谱的特点：尺寸排阻色谱的特点：•（（1 1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构分子结构的某些信息的某些信息•（（2 2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵灵敏度较低的检测器敏度较低的检测器•（（3 3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。

由）固定相与分子间作用力极弱，趋于零由于柱子不能很强保留分子，因此于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长柱寿命长•（（4 4）不能分辨分子大小相近的化合物，）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分相对分子质量差别必须大于子质量差别必须大于1010％才能得以分离％才能得以分离排阻色谱固定相排阻色谱固定相排阻色谱流动相排阻色谱流动相 必须能必须能溶解样品溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶湿凝胶当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶 另外，另外，溶剂的粘度要小溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，用而影响分离效果这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意尤需注意 必须必须与检定器相匹配与检定器相匹配常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等二甲基酸胺和水等七、亲合色谱七、亲合色谱•应用应用：主要用于：主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合生物大分子与固定相之间的特异亲合力力进行选择性分离及纯化的方法。

进行选择性分离及纯化的方法•分离原理分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的：于载体表面先键合具有一般反应性能的环环氧或联氨（称为间隔臂氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上），然后再连接上配基配基，如酶、，如酶、抗原或激素，当含有复杂混合试样的流动相流经这种抗原或激素，当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分亲合力特性的生物大分子子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相随后，改变流动相pHpH或组成，再将被保留的大分子组或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来分以纯品的形式洗脱出来•特点特点：选择性过滤、纯化效果好选择性过滤、纯化效果好第五节第五节 HPLCHPLC的应用的应用•食品检验食品检验•环境监测环境监测•生命科学生命科学•药物分析药物分析•合成化学合成化学•石油化学石油化学•临床化学临床化学•法学检验法学检验 •一一. . 在食品分析中的应用在食品分析中的应用 1 1．食品．食品营养成分营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；酸等）、有机胺、矿物质等； 2 2．食品．食品添加剂添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；蓝等）、抗氧化剂等；•食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。

素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等 •二二. . 在环境分析中的应用在环境分析中的应用•        多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等甲酸脂类，反相色谱）残留等•三三. . 在生命科学中的应用在生命科学中的应用•HPLCHPLC技术在生化领域的应用主要集中于两个方面：技术在生化领域的应用主要集中于两个方面：1. 1. 低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定2. 2. 高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定的纯化、分离和测定 •四四. . 在医学检验中的应用在医学检验中的应用        体液中代谢物测定；药代动力学研究；临体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：床药物监测：  1. 1. 合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄胺类药等。

胺类药等  2. 2. 天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、强心甙）等碱、强心甙）等。