解偶联蛋白2在PM2.5所致的氧化应激损伤心肌细胞中的作用发展策略.docx

解偶联蛋白2在PM2.5所致的氧化应激损伤心肌细胞中的作用发展策略近年来，环境污染问题备受关注，尤其是大气污染其中颗粒物是城市大气污染的重要物质，其管径大小不一，危害有别其中，空气动力学直径<2.5 μm的颗粒物被称为细颗粒物（PM2.5），与人体健康关系最为密切流行病学调查研究提示，PM2.5对人体的损害很大，尤其是呼吸系统近年来，其与心血管疾病关系的研究较多越来越多的学者认为，PM2.5不但可增加冠心病、高血压、糖尿病患者的心血管疾病的发病率和死亡率，亦可增高健康人群心血管疾病的发病率和死亡率，甚至诱发心律失常、心肌缺血乃至心跳聚停等严重情况发生笔者前期研究也发现，PM2.5可以导致H9C2心肌细胞线粒体损伤，从而引起活性氧（Reactive oxygen species， ROS）产生增多，ATP合成不足，线粒体膜电位损害，PM2.5导致的心肌细胞损伤与线粒体氧化应激过强有关【5】　线粒体是体内ROS产生的主要部位，而解偶联蛋白（Uncoupling proteins，UCPs）是线粒体内膜上能够通过转运H+降低线粒体膜电位蛋白家族，与细胞内的ROS有着密切的关系线粒体膜电位的轻微改变可以影响ROS的含量。

因此，UCPs与ROS的产生关系密切在5种UCPs的同类物中，UCP2分布最广泛在糖尿病及神经细胞的保护研究中发现，UCP2可以减少ROS的产生从而起到保护作用，其机制与其通过解偶联作用进而降低线粒体的膜电位有关笔者的前期研究也发现，通过RNA干扰沉默UCP2后，细胞内ROS产生明显增高，提示UCP2的保护作用　　氧化应激过度增强是心肌细胞线粒体功能损伤的重要因素ROS产生过多，保护因素减弱，如还原型谷胱甘肽（GSH）减少，超氧化物歧化酶（SOD）减少，丙二醛（MDA）增多，在心肌细胞损伤中作用甚大然而UCP2对PM2.5导致的氧化应激中作用如何，及其对GSH、SOD和MDA影响如何，目前研究较少本研究就在前期研究的基础上，将进一步揭示UCP2在PM2.5致氧化应激损伤心肌过程中的作用机制　　1 资料与方法　　1.1 RNA干扰片段 由上海吉凯基因公司合成2条RNA干扰片段和1条阴性对照RNA干扰片段，进行RNA干扰片段的筛选转染成功后，进行RT-PCR和Western Blot检测UCP2基因在转录水平及蛋白水平表达情况最后筛选出有效的干扰片段，即：siRNA2序列上游，5′-CCU CAU GAC AGA CGA CCU C dTdT-3′；下游，5′-GAG GUC GUC UGU CAU GAG G dTdT-3′。

具体筛选步骤见前期研究（中国医药科学，2015年第3期）　　1.2 PM2.5配制及心肌细胞处理 H9C2细胞株购自中国科学院典型培养物保存委员会细胞库，用10%小牛血清培养液，在37 ℃培养箱静置培养；1～3 d更换一次培养液当细胞生长至70%左右密度时，将细胞随机分成三组，分别为NC组，PM2.5组及PM2.5+siRNA组，每组3个样本三组细胞分别给予常规的培养基，50 μg/mL的PM2.5培养基，含PM2.5（50 μg/mL）与siRNA（80 nmol/L）的培养基刺激48 h后检测相关指标用PM2.5采样仪采集PM2.5，超声震荡，洗脱颗粒物，冷冻真空干燥成干粉，-20 ℃保存备用具体实验步骤见前期研究【5】　　1.3 ROS的检测 按照活性氧检测试剂盒进行操作，购自碧云天，货号S0033简要步骤为：各组细胞经过处理后，按照试剂说明用1∶1000无血清培养液稀释DCFH-DA去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，然后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次用荧光分光光度计检测，激发波长488 nm和发射波长535 nm。

　　1.4 GSH、总SOD及MDA的检测 GSH比色法测定原理：二硫代二咲-硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，故可进行比色定量测定采用谷胱甘肽测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，货号为A006SOD可清除超氧阴离子，从而抑制甲赞的形成，反应液蓝色越深，说明SOD酶的活性愈低，反之则酶活性愈高总SOD的检测采用总SOD活性检测试剂盒（NBT法），购自碧云天，产品编号为S0107过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，故可用分光光度计对其进行量化MDA的检测采用丙二醛测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，货号为A003-1GSH、总SOD及MDA的检测均严格按照试剂盒说明书进行操作　　1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，方差齐时，采用单因素方差分析进行统计，两组间比较采用LSD法分析，以P<0.05为差异具有统计学意义　　2 结果　　2.1 各组心肌细胞ROS和MDA的比较 PM2.5+siRNA组心肌细胞内ROS含量明显高于PM2.5组，PM2.5组的ROS明显高于NC组，三组两两之间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

而MDA在PM2.5+siRNA组最高，PM2.5组其次，NC组最低，三组见两两比较有统计学意义（P<0.05），见表1　　2.2 各组心肌细胞GSH含量及总SOD活性的比较 PM2.5+siRNA组、PM2.5组和NC组三组之间的GSH含量和总SOD活性比较差异均有统计学意义（P<0.05）；两指标均在PM2.5+siRNA组最低，在NC组最高，PM2.5组位于中间，且两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2　　3 讨论　　PM2.5作为大气污染的重要物质，可作为载体吸附有毒重金属、酸性氧化物、有机污染物、细菌和病毒等多种组分，严重危害人体健康PM2.5可以损害人类的呼吸系统及心血管系统，很多研究均发现其是心血管疾病的促进因素之一深入研究PM2.5导致心肌细胞损伤的机制，为临床治疗PM2.5所致的远期心肌损伤提供基础研究支持，具有重要意义　　解偶联蛋白（UCPs）是线粒体上的质子转运蛋白，属于线粒体阴离子通道家族UCPs基因有高度的保守性，有6个家族成员，在人仅表达UCP1-5UCP2蛋白广泛表达于心肌、肝脏、胰腺以及脑组织等，现在多数认为其是保护性因素，特别是对胰岛细胞及神经细胞的保护作用研究较多。

笔者前期研究发现，PM2.5可以导致心肌细胞明显损坏，导致肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）升高，损害线粒体的超微结构，导致线粒体肿胀，嵴断裂，从而导致线粒体膜电位的改变【5】通过RNA干扰技术沉默UCP2基因的表达后，心肌细胞的线粒体产生更多的ROS，并导致ATP含量的显著下降，进一步加重了心肌细胞的损害这提示，UCP2在PM2.5致线粒体的损伤中起着保护性的作用　　活性氧（ROS）是指具有氧化还原潜能的氧衍生物，包括游离的基团如：超氧阴离子、羟自由基、次氯酸盐、过氧亚硝酸盐和稳定的基团如过氧化氢各种细胞均能产生ROS，其来源包括NAD（P）H氧化酶、线粒体、黄嗓吟氧化酶和环氧合酶等生理状态下，线粒体产生少量的ROS，对细胞有利；在某些病理条件下，线粒体产生大量的ROS，导致细胞器、DNA以及膜结构等损坏，甚至导致细胞凋亡、坏死GSH和SOD是清除机体过多ROS的重要防御系统超氧化物通常在SOD的作用下，转化为过氧化氢GSH与过氧化氢结合，后者则转化成水，减弱ROS的损害作用MDA是脂质过氧化产物，其含量的改变可以间接反映ROS对脂质的损害作用，受到学者的广泛应用本研究发现，PM2.5可以导致心肌细胞氧化应激增强，ROS产生过多，从而导致脂质过氧化加剧，表现为MDA的含量明显升高；此外ROS的过度增多，消耗了过多的GSH，导致GSH含量明显下降；同时也消耗了大量的SOD，减弱了SOD的活性，导致心肌细胞抗氧化作用体系减弱。

这与其他学者的发现是相一致的　　通过RNA干扰技术，沉默心肌细胞UCP2的表达，笔者发现，PM2.5导致的心肌细胞氧化应激损伤进一步加剧，表现为：ROS含量进一步堆积，MDA含量进一步升高，从而过度消耗了机体的抗氧化酶，导致GSH含量明显降低以及SOD活性明显下降而笔者在前期实验发现，PM2.5可以导致线粒体损伤，而沉默UCP2可以加重线粒体损伤【5】人为地抑制UCP2的保护作用，将导致细胞损伤的进一步加剧这也间接地证明：UCP2在PM2.5导致的心肌细胞损伤中起着保护性的作用这可能是UCP2通过调控线粒体膜电位，进而影响氧化应激的机制所介导的目前，PM2.5对线粒体的影响，国内外也有少量研究然而本实验也存在明显的不足：（1）仅采用基因沉默的方法，没有采用基因过表达方法探讨UCP2对氧化应激的作用；（2）在指标检测方面，没有观察线粒体的形态，检测线粒体的膜电位及线粒体生物修复功能　　综上所述，PM2.5可以导致氧化应激增强进而损害H9C2心肌细胞；RNA干扰UCP2基因的表达后，可导致心肌细胞的氧化应激损伤进一步加重这提示，UCP2在PM2.5导致的氧化应激损伤过程中可能起着保护性作用。

　　参考文献　　【1】 Conti B，S Sugama，J Lucero，et al.Uncoupling protein 2 protects dopaminergic neurons from acute ，2，3，6-methyl-phenyl-tetrahydropyridine toxicity. J Neurochem， 2005，93（2）：493-501.　　【2】董晨，宋伟民，施烨闻.PM 2.5颗粒物引起血管内皮细胞氧化损伤的研究.卫生研究，2005（2）：169-171.　　【3】 Berger A，W Zareba，A Schneider，et al.Runs of ventricular and supraventricular tachycardia triggered by air pollution in patients with coronary heart disease.J Occup Environ Med，2006，48（11）：1149-1158.　　【4】 Mills N L，H Tornqvist，M C Gonzalez，et al.Ischemic and thrombotic effects of dilute diesel-exhaust inhalation in men with coronary heart disease.N Engl J Med，2007，357（11）：1075-1082.　　【5】郑贵浪，廖保南，林千文.PM2.5通过线粒体介导的大鼠心肌细胞损伤作用机制的初步研究.中国心血管病研究，2014，12（10）：939-942.　　【6】 Basu Ball W，S Kar，M Mukherjee，et al.Uncoupling protein 2 negatively regulates mitochondrial reactive oxygen species generation and induces phosphatase-mediated anti-inflammatory response in experimental visceral leishmaniasis.J Immunol，2011，187（3）：1322-1332.　　【7】 Mailloux R J ，M E Harper.Uncoupling proteins and the control of mitochondrial reactive oxygen speci。