DNA重组之目的基因的分离(63页PPT).pptx

Review第三部分第三部分 目的基因的分离目的基因的分离目的序列已知：目的序列已知：l一般采用一般采用PCR技术或技术或分子杂交技术分离克分子杂交技术分离克隆目的基因隆目的基因 目的序列未知：目的序列未知：l差异表达序列差异表达序列l无差异表达的目的序无差异表达的目的序列，可采用文库筛选列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、法、功能蛋白分离法、序列克隆法序列克隆法一、目的基因的功能克隆一、目的基因的功能克隆l根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息，在获知基因的功根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息，在获知基因的功能后克隆能后克隆l其具体作法是其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因l(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸寡核苷酸探针探针从从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因库或基因组文库中筛选编码基因l(2)将相应的编码蛋白制成相应将相应的编码蛋白制成相应抗体探针抗体探针，从，从cDNA表表达文库中筛选相应克隆达文库中筛选相应克隆。

二、二、序列克隆法序列克隆法l根据已知基因序列或同源基因序列分离目的根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因基因l采用核酸探针杂交筛选或用采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分技术进行分离离三、差别杂交法三、差别杂交法l适用范围：适用范围：l组织组织特异性表达特异性表达或特定发育阶段表达的基因或特定发育阶段表达的基因l 受生长因子调节的基因受生长因子调节的基因l 经特殊处理诱导表达的基因经特殊处理诱导表达的基因应用前提应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）基本过程基本过程l制备两种细胞群体的的制备两种细胞群体的的mRNA提取物提取物l以两种总以两种总mRNA或或cDNA为探针为探针l以表达目的基因的细胞群体构建以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库文库有目的基因表达的有目的基因表达的mRNA探针，重组体菌落阳性反应探针，重组体菌落阳性反应目的基因不表达的目的基因不表达的mRNA探针，除目的基因之外，其余菌落都探针，除目的基因之外，其余菌落都为阳性反应为阳性反应 比较底片，对照原板，可挑选出含选目的基因的菌落比较底片，对照原板，可挑选出含选目的基因的菌落cDNA文库母板目的基因有表达目的基因无表达无有无有说明含目的基因说明含目的基因四、减法杂交技术四、减法杂交技术l又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交l本质：尽量本质：尽量去除两种样品中普遍共同存在的基因序列去除两种样品中普遍共同存在的基因序列，从，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离的敏感性分离的敏感性两种策略：两种策略：lmRNA减法杂交减法杂交l基因组减法杂交基因组减法杂交mRNA减法杂交减法杂交l提取表达目的基因的细胞提取表达目的基因的细胞mRNA，反转录成，反转录成cDNAl 提取不表达目的基因的细胞提取不表达目的基因的细胞mRNAl 过量杂交过量杂交l两种组织中均表达的基因产物形成两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA杂交分子杂交分子l 特异特异mRNA反转录的反转录的cDNA片段仍保持单链片段仍保持单链减数杂交技术分离减数杂交技术分离差异表达基因差异表达基因DNA/RNA杂交分子可结合在羟基杂交分子可结合在羟基磷灰石柱上，而游离的单链磷灰石柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。

回收的则过柱流出回收的cDNA转变为转变为双链双链cDNA后克隆倒适当的载体中，后克隆倒适当的载体中，就成为一个减数文库就成为一个减数文库五、mRNA差别显示技术l又称为差别显示反转录又称为差别显示反转录PCR（DDRT-PCR）l目的序列未知，目的序列未知，1992年由美国哈佛大学医学年由美国哈佛大学医学分校分校Dena-Farber研究所的两位科学家研究所的两位科学家Liang和和Pardee首次提出的，并运用这种方法来分首次提出的，并运用这种方法来分离一对培养的哺乳动物细胞中差别表达的基离一对培养的哺乳动物细胞中差别表达的基因至今，运用因至今，运用mRNA差别显示技术分离、差别显示技术分离、鉴定的差别表达基因大约有鉴定的差别表达基因大约有300多个3 端锚定引物端锚定引物l锚定引物的通式是锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，其中，其中M为为A、C、G中的任意一种，中的任意一种，N为为A、C、G或或T中的任意一种，中的任意一种，所以所以共有共有12种种oligo(dT)12MN引物，用这引物，用这12种引物分种引物分别对同一总别对同一总RNA样品进行样品进行cDNA合成合成，即进行，即进行12次不同次不同的反转录反应，每一种的反转录反应，每一种3 端锚定引物，都能够把总端锚定引物，都能够把总mRNA群体的群体的112分子反转录成分子反转录成mRNA-cDNA杂交分杂交分子。

子l这样可以将整个这样可以将整个mRNA群体在群体在cDNA水平上，分成水平上，分成大致相等但序列结构不同的大致相等但序列结构不同的12份亚群体这一过份亚群体这一过程叫做程叫做差异显示反转录差异显示反转录，即，即DDRT5端随机引物端随机引物l另外，还需要另外一种另外，还需要另外一种由由10个核苷酸组成的个核苷酸组成的5端随机端随机引物引物l这种这种5 随机引物可以同特定细胞类型的总随机引物可以同特定细胞类型的总mRNA群体群体中的一部分分子发生杂交作用，而且杂交部位是随机中的一部分分子发生杂交作用，而且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的地分布在距每条新合成的cDNA链链3端的不同位置上端的不同位置上l用用3 端锚定引物和端锚定引物和5 随机引物组成的引物对，以随机引物组成的引物对，以mRNA/cDNA为模板进行为模板进行PCR扩增，然后经过扩增，然后经过23h的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以显示出在的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以显示出在100500bp之间的之间的DNA条带条带l20种种 5端随机引物端随机引物l12种种 3端锚定引物端锚定引物l240组引物，进行组引物，进行PCR lPCR过程中加入放射性标记过程中加入放射性标记l变型聚丙烯酰氨凝胶电泳变型聚丙烯酰氨凝胶电泳l放射自显影显示差异表达条带放射自显影显示差异表达条带l对差异表达条带进行割胶回收并制备成探针，从文对差异表达条带进行割胶回收并制备成探针，从文库中筛选库中筛选差别显示分析基本流程差别显示分析基本流程基本程序基本程序l提取两种细胞的总提取两种细胞的总mRNA,反转录后成为反转录后成为2种种cDNAl以一定的引物作随机聚合酶链反应以一定的引物作随机聚合酶链反应l通过扩增产物的电泳分析通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样分离出不同样品间的差异条带品间的差异条带l将差异将差异DNA做成探针做成探针l 在在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析作功能分析 优点：优点：几乎可检测细胞表达的所有基因几乎可检测细胞表达的所有基因 可同时比较多种细胞类型可同时比较多种细胞类型 可同时展现所有差异可同时展现所有差异 用量少，操作简单，快速高效用量少，操作简单，快速高效缺点缺点：12种锚定引物和种锚定引物和20种随机引物，种随机引物，240次次PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段小于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段小于500bp 有些差别条带成簇出现，造成假阳性有些差别条带成簇出现，造成假阳性 缺乏定量分析手段，判断差异条带有难度缺乏定量分析手段，判断差异条带有难度第六章 DNA重组的操作第一节 受体细胞 易于重组易于重组DNADNA分子的导入分子的导入 能使重组能使重组DNADNA分子稳定存在于细胞中分子稳定存在于细胞中 便于重组体的筛选便于重组体的筛选 遗传稳定性高遗传稳定性高 安全性高安全性高 有利于外源基因的高效分泌表达有利于外源基因的高效分泌表达 在遗传密码的应用上无偏倚性在遗传密码的应用上无偏倚性 具有较好的转译后加工机制具有较好的转译后加工机制 有较高的应用价值有较高的应用价值1、原核生物细胞是较为理想的受体细胞 大多原核生物没有坚硬的细胞壁 没有核膜，有利于外源片断重组 基因组简单，便于对外源基因进行遗传分析 多为单细胞生物，繁殖迅速，过程简单缺陷：以原核生物表达真核生物基因存在问题，很多真核生物基因不能在E.coli中表达具生物活性的功能蛋白。

缺乏真核生物蛋白质折叠复性系统 缺乏蛋白质加工系统 原核生物内源蛋白易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定常用受体菌：大肠杆菌 人胰岛素、生长素、干扰素等 枯草杆菌 人干扰素、白细胞介素 乙肝病毒核心抗原等 蓝藻 易于表达植物基因2、真菌细胞低等真核生物酵母菌：以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核微生物，易于表达外源真核基因 基因结构最为简单的真核生物之一 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统 不含有特异性病毒，不产生毒素 培养简单 可将外源基因表达产物分泌至胞外3、植物细胞 坚硬的细胞壁 纤维素酶处理原生质体 摄取外源片断全能性：在合适的培养条件下，一个分离的活细胞可分化成植株水稻，棉花，玉米，马铃薯，烟草等4、动物细胞早期：生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞现在：体细胞培养动物：猪、羊、牛、鱼、鼠、猴等 生产天然状态的复杂蛋白质 动物疫苗 动物品种的遗传改良 人类疾病的基因治疗第二节 重组体导入受体细胞2.1 重组质粒DNA转化大肠杆菌 转化（transformation）定义转化微生物的种类感受态细胞 P139转化过程供体（donor）：提供DNA的生物受体（recipient or host）：获得DNA的生物1.定义l转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。

l转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代2.转化微生物的种类 首次发现转化现象 肺炎链球菌（Griffith,1928）嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等3.感受态感受态（competence）感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响肺炎链球菌 对数生长后期芽孢杆菌属 指数期末和稳定期大肠杆菌 刚进入对数期DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右 大肠杆菌 革兰氏阴性菌 细胞表面的结构和组成与革兰氏阳性菌不同 转化因子的吸收较为困难 人工制备感受态细胞4.转化过程大肠杆菌的转化方法：Ca 2诱导大肠杆菌转化法 电穿孔转化法 三亲本杂交接合转化大肠杆菌1、Ca 2诱导大肠杆菌转化法 培养培养生命活动旺盛的菌体生命活动旺盛的菌体 菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长期菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长期 沉淀菌体沉淀菌体 冰水浴中预冷冰水浴中预冷10分钟，分钟，4 4 离心离心 化合物处理化合物处理 含含CaCl2 无菌无菌预冷缓冲液处理预冷缓冲液处理 DNA分子转化感受态细胞分子转化感受态细胞制备感受态细胞的注意事项制备感受态细胞的注意事项1.细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:l不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从70或或 20甘油保存的菌种甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

中直接转接用于制备感受态细胞的菌液l细胞生长密度以刚进入细胞生长密度以刚进入对数生长期对数生长期时为好，可通过监测培养。