纤维素素分解菌筛选及酶活测定.docx

摘要 IAbs trac t Ill1材料与方法 41.1材料 41. 1. 1上壤样品 41.1.2竣甲基纤维素钠培养基⑶ 51.1.3刚果红培养基⑷ 51. 1.4活化培养基⑶ 51. 1.5复筛培养基（质量比％）⑸ 51. 1.6 DNS试剂（二硝基水杨酸试剂）⑺ 51. 1.7葡萄糖标准溶液⑹ 51.2方法 51.2. 1取样与处理 51.2.2 初筛 51.2.3 纯化 51.2.4活化培养 61.2.5复筛培养和粗酶液提取 61.2.6酶活测定 61.2.6. 1葡萄糖标准曲线绘制 61.2.6. 2 FPA酶活测定囚 72 结果分析 73小结 94纤维素分解菌前景展望 9参考文献 11致谢 错误！未定义书签摘要本实验目的是分离出上壤中的纤维素酶产生菌，通过平板培养分离出纤维素酶产 生菌，后经活化，在进行复筛发酵，离心収上清液并测FDA酶活结果表明本实验所 分离得到的这4株菌酶活并不高，酶活最高的为1.304U,最低的为0.918U,需进一步 提咼最后将该4株菌株保藏待用关键词：纤维素分解菌，筛选，酶活IIAbstractIn this experiment, we utilize the carboxymethyl cellulose medium and Congo-red medium which use the CMC-Na as carbon source, and isolate 6 bacterial strains which can decomposit cellulose that firom the soil named Mao Hongchun,then we select 4 hydrolysis of obvious strains of bacteria: 1,2,3,5. on the Congo-red medium.After the shake-flask activation culturing for 6 days , then training for 7 days on the compound screening medium which use the debris of rice straw as the sole carbon source,Taking the supernatant of fermentation centrifugal and diluting ,then we make it react with filter paper . After the response we determinate the sugar concentration through the3,5-dinitrosalicylic acid method .then calculate its enzyme activity according to the formula.The results indicate that the enzyme activity of 4 bacterial strains which were isolated in our experiment was not high, the highest enzyme is 1.304U and the minimum is 0.918U.So it needs to be further improved. At last we preserve the 4 bacterial strains so that we can use in the future.Key words : Cellulose-decomposing microorganisms ; select; enzyme activity纤维素是-•种巨大的可再生资源，占植物干重的35%~50%⑴，是地球上分布 最广、含量最丰富的碳水化合物，是植物秸秆、木材、纸张、棉麻等的主要组分。

但由于其利用率很低，既造成了生物资源的浪费，有对环境造成了很大的污染 如何将这些生物资源加以充分利用是目前亟待解决的问题作为一种可持续资源, 纤维索越来越受到人们的重视可通过纤维素酶将纤维素转化为食品、饲料和各 种工业原料，分解纤维素的微生物对纤维素的分解利用，对环境污染问题、能源 短缺问题有重要意义⑵自然界中能降解和利用纤维素的微生物种类繁多，真菌、 细菌、放线菌以及部分酵母菌等主耍的微生物类群中都有具有降解纤维素能力 的放线菌主要有纤维素放线菌、诺卡氏菌属和链霉菌属，但放线菌产量极低，所 以研究很少真菌由于具有较高的胞外酶活性且其酶种类比较全面使其有很强的 纤维素降解能力，因此对其的研究报道比较多其中主要以木霉属、曲霉属、青 霉为主，木霉属所产生纤维素酶的组分比较齐全，但B-葡萄糖甘酶活性较低， 产酶速度慢，作用PH范围窄，耐低温性差等问题；黑曲霉是优良的产葡萄 糖甘酶菌株，但酶系组分较为单一，青霉属中的一些种类不仅能分泌组成齐全、 酶活较高的纤维素降解酶系，而且具有易培养、生长快的优势，但由于研究较少， 对其所产生酶系需要更全面、深入的认识⑻虽然冃前在纤维素酶高产菌选育方而的研究已取得较好的成效，但高酶活纤 维素分解菌的分离选育人具有重要意义。

本实验从十.壤中筛选出数种纤维素分解 菌，通过复筛选岀酶活较高的菌株并保藏，旨在扩人纤维索分解菌种质资源，为 高晦活纤维素分解菌的育种提供材料1材料与方法1.1材料1. 1.1 土壤样品样品：毛红椿根际土壤1. 1.2竣甲基纤维素钠培养基⑶CMC-Na 15g, NH4NO3 lg,駙膏 lg, MgSO4-7 H20 0.5g, KH2PO4 lg,琼脂14g,蒸憎水1000mlo1.1.3刚果红培养基⑷微晶纤维素 1.88g； MgSO4 0.25g； K2HPO4 0・50g；刚果红 0.2g； 琼脂20g；明胶2.0g； 土壤浸岀液100ml；蒸憾水900ml； pH白然1.1.4活化培养基⑶去皮土豆200g,葡萄糖20g,加水至1000mlo1.1.5复筛培养基（质量比％）⑸稻草碎屑 2g,蛋白腺 0.2, （NH4） 2SO4 0.8, KH2PO4 0.4,MgSO4-7H2O 0.1, Tween-80 0.21. 1.6 DNS试剂（二硝基水杨酸试剂）⑺称取6.5g 3,5■二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000ml容量瓶中， 加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml,再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容 至 1000ml1. 1.7葡萄糖标准溶液⑹将葡萄糖105°C干燥2h,称取0.125g,溶于少量水中，倒入250ml 容量瓶定容，即制得500ug/ml荊萄糖标准溶液。

1. 1.8醋酸-醋酸钠缓冲液PH=4.5醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,加水稀释至1000mlo1 - 2方法1.2. 1取样与处理挖取毛红椿根际上壤，用无菌报纸盛装，称収10g 土样，加入50g 无菌水，将样晶打散混合均匀，即成10" 土壤稀释液，然后制成IO4, IO 5, 10一6的稀释液1.2.2初筛吸取上述三个梯度的稀释液0.1ml分别涂布在竣甲基培养基上，每个梯 度接三个培养皿并做标记，在培养箱内30°C培养3d1.2.3纯化挑取透明水解圈较大的菌落，在刚果红培养基上划线，编号；后放入30°C培养箱培养3d,观察具水解情况1.2.4活化培养选择水解较为明显的菌株用接种环挑取1 nf,接入装有100ml活化培 养基的锥形瓶中；37°C, 148r/min,摇床震荡培养6d,并观察瓶内发酵液 变化1.2.5复筛培养和粗酶液提取将活化发酵液摇匀分别吸取lml接种到装有200ml复筛培养基的锥形 瓶中，27 °C, 148r/min振荡培养7d所得发酵液经4000r/min 20min,收集 上清液作为粗酶液用于测酶活1.2.6酶活测定1.2. 6. 1葡萄糖标准曲线绘制表1标准液试剂添加表管号0123456葡萄糖标 准液00.20.40.60.81.01.2蒸馅水2.52.32.11.91.71.51.3DNS2.52.52.52.52.52.52.5取大试管7支，编号，按表1用吸管准确吸取500ug/ml葡萄糖标准溶 液与蒸谓水混匀，然后各试管中加入DNS试剂2.5ml,将各管摇匀，沸水浴 5min,取出后立即置冷水中冷却。

在722型分光光度计上比色，选用540mn 波长和lcm厚的比色血，用0号管作为空白，读取1・6号管的吸光值，以吸 光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线7 6o.O.(V)赳晝o o OQ 1 1 1 1 1 1 10 20 40 60 80 100 120 140浓度(ug/ml)DNS法葡萄糖标准曲线图2葡萄糖标准曲线1.2. 6.2 FPA酶活测定⑵取40mg （1x4cm）滤纸条，将离心后的酶液稀释20倍，吸取0.5ml, 移入试管中，力口入2.0mlPH=4.5的HAGNaAC缓冲液，放入40°C恒温水浴 中糖化30min,取出加入DNS试剂2.5ml,摇匀，取出滤纸条，沸水浴5min, 在冷水中冷却同上，0管为对照，722型分光光度计，540nm测得OD值， 查阅葡萄糖标准曲线，求得还原糖浓度酶活公式：[（c x n x 10） x 2]酶活= t x 0.5 x 180注:纤维素酶活力的国际单位：iml酶底物反应液Imin内产生相当也1 ug/ml 葡萄糖的还原糖量规定为1国际单位（1U）其中，梅活：U/g； 0.5： 0.5ml悔液参加 反应；c:还原糖浓度，据OD査得ug/ml； 10: 10ml卿液/g； n：稀释倍数，测定晦活时 酶液稀释倍数；（：酶作用时间，30min； 180：葡萄糖分子量；2：糖化反应后加入DNS 试剂2.5ml将反应液稀释了一倍。

1.2.7菌种保藏在无菌环境下挑取1、2、3、5号菌，在试管斜面上划线（培养基 为竣甲基纤维素钠培养基），30°C培养7cl,移入冰箱中4°C保藏2结果分析分离得到在刚果红培养基上水解比较明显的4株菌落1、2、3、5图1刚果红培养图在摇瓶活化培养过程中，1号菌株产生菌丝球且发酵液颜色变深可能为 放线菌或真菌，其余三种菌并无菌丝球产生且颜色各异，相对1号菌都比较 浅各种菌的性质类别有待鉴定本次试验筛选出來的菌株酶活（表2）都比较低，酶活最高的是3号 菌，酶活为1.304U；酶活最低的是1号菌，为0.918Uo有待进一步诱变育 种表2 FPA臨活测定结果编号0D糖含量(ug/ml)酶活(U)0.0216.20.918♦▲0.0236.60.978■■0.0348.81.304■■0.030&01.183当前对纤维索分解菌的选育已经有了不错的成效，其选育方式也更加 多样化，单纤维素酶的生产依然存在酶活低、生产周期长、生产效率低等诸 多问题，还不能工业化大规模生产如何提高稱的产量是一个值得研究课题， 有重要的实际意义培养基成分和培养条件等对纤维素酶的生产有重要影响, 研究如何优化培养条件从而提高纤维素酶的酗活也是一个重要课题。

3小结3. 1通过平板竣甲基纤维素钠法筛选出6株水解圈较明显较大的菌株广。