利用spectramaxi3x多功能微孔板读板机.pdf

优势：利用SpectraMax i3x多功能微孔板读板机 所具有的超灵敏化学发光检测功能进行细胞 活力和细胞毒性的评价简介方法 准备试剂 • 仪器具有超高灵敏度化学发光检测功能，最低至10个细胞/每孔；• 微孔板读板高度自动优化设置，可提高检测信号强度• 软件预置模板可以更快分析出检测结果SpectraMax i3x是Molecular Devices公 司最新推出的一款多功能微孔板读板机， 可利用仪器所具有的化学发光检测功能， 进行细胞活力和细胞毒性相应检测仪器 可灵敏、快速检测出培养基中活细胞的数 目 和 经 相 应 处 理 后 细 胞 毒 性 情 况 Promega公司推出的CellTiter-Glo试剂是 利用了萤火虫荧光素酶反应体系中需要 ATP参与才能使其发光的特点，化学发光 信号强弱取决于培养基中ATP含量的高 低，也就是依赖于其中活细胞数目的多 少来自于BioVision公司基于生物化学发 光原理的细胞毒性检测试剂盒，目的是检 测腺苷酸激酶(AK)的含量，AK为一种存在 于所有细胞中的常见蛋白，当破坏了细胞 膜完整性后其会释放至培养基中，AK可转 化ADP至ATP，所以可以利用类似方式进 行化学发光检测。

材料 • CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega P/N G7570) • Bioluminescence Cytotoxicity Assay Kit (BioVision P/N K312-500) • HeLa 细胞(ATCC P/N CCL-2) • 黑色底透 96孔细胞培养板 (Corning P/N 3904) • 白色96孔细胞培养板(Corning P/N 3917) • SpectraMax i3x多功能微孔板读板机使用前预先将CellTiter-Glo缓冲液和底物 解冻并且平衡其至室温，将CellTiter-Glo 缓冲液加至含有CellTiter-Glo底物的棕色 小瓶中，按照试剂盒说明书提示，将试剂 轻轻反复颠倒进行混匀对于生物化学发 光细胞毒性检测试剂盒，其中包含了1瓶 AK检测试剂，此试剂使用前预先将1.1ml AK试剂缓冲液加入其中并轻轻混匀，需在 室温环境下平衡15分钟后使用这个10X 的AK试剂的储存液需要稀释后才能成为试 剂缓冲液细胞数目与化学发光信号关系 Hela 细胞培养在含有10%胎牛血清和双抗 的MEM培养基中，细胞经胰酶消化后，使 其悬浮于培养基中进行计数。

处理后的细 胞铺在96孔板中，经细胞培养基稀释后其 密度从50,000细胞每孔/100ul至10个细胞 每孔/100ul如果将细胞铺在384孔板时， 稀释后密度从12,500细胞每孔/25ul至6个 细胞每孔/25ul对照孔中仅需加入细胞培 养基用于检测其背景的化学发光信号值细胞试验过程中，精确的细胞数目可用于 生成标准曲线，将不同体积的CellTiter- Glo试剂加入相应的孔板中，如100ul(96 孔板)或25ul(384孔板)将微孔板放置于 振荡器上轻混2分后，室温条件下孵育10分 钟，等化学发光信号值稳定后再进行检 测ParameterSelected settingOptical configurationMonochromatorRead ModeLUMRead TypeEndpointWavelengthsAll WavelengthsPlate types (specific to each assay format)96 Well Costar clear 384 Well Greiner clear*PMT and OpticsIntegration Time: 1000 ms Read Height: 5.86 to 8.09 mm (assay dependent)**More SettingsShow Pre-Read Optimization Options* The 384-well microplate plate definition was optimized using the Microplate Optimization Wizard in SoftMax Pro Software. ** Read height was optimized for each assay using the Read Height Optimization Wizard to ensure optimal signal detection.表一：化学发光检测时如何设置读板机的参数Cell standard curvesCell standard curvesATP标准曲线 ATP以1:10稀释度进行稀释后加入96孔板 和384孔板中，浓度从10uM至1nM，不加 细胞的孔作为空白孔。

CellTiter-Glo试剂可 用于检测ATP，检测前可利用SpectrMax i3x具有的微孔板优化设置和读取高度优化 设置功能，帮助你获得更佳信号值细胞活力和细胞毒性试验 将Hela细胞预铺在白色底透的细胞培养型 96孔板中，密度为15,000/孔，培养过夜 第 二 天 在 细 胞 孔 中 加 入 十 字 孢 碱 (staurosporine)和茴香霉素(anisomycin) 这两种化合物来诱导细胞凋亡这两种化 合物起始浓度都为50uM，并以1:2方式稀 释至24nM再经过24小时孵育以后，分 别使用CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒 和BioVision的细胞毒性检测试剂盒对处理 后的细胞进行检测对于CellTiter-Glo细胞活力检测试验，将 100ul的CellTiter-Glo试剂加入含有细胞 的白色微孔板中，等10分钟左右，当细胞 彻底裂解以后再进行相应检测对于BioVision细胞毒性检测试验，每孔中 取100ul处理后的细胞培养基，将其转移至 白色微孔板中，并在白色微孔板中加入 100ul的AK工作液，此方法需要在30分钟 内完成检测仪器设置和结果分析 SpectraMax i3x读板机参数设置如表一所 示。

使用专业级别的SoftMax® pro软件后， 可直接获得平均相对化学发光信号值 (RLU)和标准偏差值直接绘制出细胞稀 释度曲线和ATP标准曲线，选择其中的4参 数拟合方式进行拟合后快速计算出其IC50 值 软 件 预 置 模 板 库 中 还 有 针 对 CellTiter-Glo检测试验的模板可方便直接 调用结果 SpectraMax i3x读板机针对96孔板和384 孔板进行检测时，最低检测下限可至10细 胞每孔此种检测方法的灵敏度远远高于 标 准 比 色 法 和 绝 大 多 数 荧 光 法 CellTiter-Glo试剂检测线性范围覆盖所有 细胞浓度区间，动态学检测范围大于3个数 量级且r2 > 0.99（图一）图一：图中分别是96孔板的标准曲线(蓝色圆圈)和384孔板的标准曲线(红色圆圈)，在每种类型的 微孔板中，检测下限可至10个细胞每孔，两条曲线的标准方差值r2 > 0.99图二：96孔板中ATP标准曲线(红色圆圈)和384孔板中ATP标准曲线(绿色圆圈)，两个标准曲线 的r2 = 0.999Cell viability assayCytotoxicity assay结论 在利用SpectraMax i3x读板机化学发光检 测功能进行基于ATP变化的细胞活力和基 于AK变化的细胞毒性检测时其表现出了超 高灵敏性，检测下限可至10个细胞每孔。

可通过专业级别的SoftMax Pro 软件进行 四参数拟合，随后直接计算出IC50值软 件可以自动优化微孔板的检测高度，可帮 助用户获得最佳的信号值主机除了具有化学发光检测功能以外， SpectraMax i3x读板机可升级具有更多检 测功能以满足用户对不同试验的不同检测 需求此仪器的光吸收和荧光强度检测功 能，光源采用了专利的光谱融合技术 (Spectra FusionTM Illmumination)使其 既可以兼顾了波长灵活性也可以获得最佳 检测信号主机可加入具有新检测功能的卡盒，用户 自己可随时进行功能升级，包括时间分辨 荧光检测功能和Western Blot检测功能， 也可选配Spectra® MiniMaxTM 300细胞成 像模块，扩展此读板机检测能力和应用范 围仪器所有功能均可以使用一种软件进 行操作，即专业级别的SoftMax Pro软件， 其中包含了CellTiter-Glo等近120预置检 测模板可方便用户自己快速进行数据收集 和数据分析图三：Hela细胞经十字孢碱(红色圆圈)和茴香霉素(绿色圆圈)处理24小时后浓度效应学曲线，十 字孢碱IC50值为0.34uM，茴香霉素IC50值为3.30uM。

图四：Hela细胞经十字孢碱(红色圆圈)和茴香霉素(绿色圆圈)处理24小时后浓度效应学曲线使 用BioVision细胞毒性检测试剂盒来检测细胞内AK活性变化，十字孢碱IC50值为0.15uM，茴香霉素IC50值为2.28uMATP标准曲线既可以验证试验条件也可以 用来计算细胞内ATP的含量因此，ATP 标准品浓度范围从1nM至10uM产生的化学 发光信号范围可覆盖整个不同细胞数目孔 中产生的信号值(图二)，检测的线性范围大 于四个数量级经十字孢碱(staurosporine)和茴香霉素 (anisomycin)等化合物处理后细胞其活力 的变化可通过检测ATP水平而实现(图三) 细胞毒性可以通过检测其AK量变化而实现 (图四)十字孢碱(0.34uM和0.15uM)和茴 香霉素(3.30uM和2.28uM)两次处理试验 获得相似的IC50值扫一扫关注我 们的官方Molecular Devices 大中华区 Email: info.china@ www.MolecularD www.MolecularD上海 : 86-21-3372 1088 : 86-21-3372 1066 地址: 上海市徐汇区宜山路1388号民润大厦8楼 201103北京 : 86-10-6410 8669 : 86-10-6410 8601 地址: 北京市朝阳区广渠东路3号中水电国际大厦612&613室 100124成都 : 86-28-6558 8820 : 86-28-6558 8831 地址: 成都市锦江区东御街18号百扬大厦2208室 610016 台北 : 886-2-2656 7585 : 886-2-2894 8267 地址: 台北市内湖区堤顶大道二段89号3楼香港 : 852-2248-6000 : 852-3010 2828 地址: 香港皇后大道东1号太古广场三座4楼406-9。