抗氧化测定方法（三种）.docx

实验一 超氧阴离子自由基清除能力的测定——抗氧化实验之一一 、目的要求通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧 阴离子自由基清除能力测定的方法二、实验原理超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴 离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超 氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多 种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02-・，02-能加 速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s〜45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02-的浓度，清除02-就可以抑制自氧 化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的三、 器材及试剂（一）器材 恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光 度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容 量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。

二）试剂邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、HCI、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏 血酸、 BHT 等1） pH8.2 的 Tris-HCl 缓冲液（0.05mol/L，25 °C）： 50ml 0.1mol/L 三 羟甲基氨基甲烷（Tris ）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至 100ml2） 0.2mmol/L 邻苯三酚溶液（邻苯三酚用 0.05mol/L 的盐酸配制 ）四、 操作步骤（一）样品的测定（1） 先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比色管中分别 加入4mL （0.05mol/L） pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25C水浴中预热20min， 然后加入25C水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25C水浴中预 热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制）， 混匀后在25C水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测 定吸光度（A样）每管做三个重复，取平均值2） 同上述过程，只是用1mL的蒸馏水代替样品液，测定结果为原始管（A 原）每管做三个重复，取平均值。

结果计算：A原——A样0 -•清除率（％） = x 100%2 A原注意：A样参比：缓冲溶液4ml+1ml样液+lmlHCl （0.05mol/L）代替邻苯三酚溶液 A原参比：缓冲溶液4ml+1ml水代替样+lmlHCl （0.05mol/L）（二）阳性对照试验 将抗坏血酸等抗氧化药品配制成梯度浓度，与提取样品一起进行抗氧化实 验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力方法同样品的测定，只是将样品 用抗氧剂代替即可实验二 羟自由基清除能力的测定——抗氧化实验之二方法一：羟自由基（• OH）清除能力的测定——E二氮菲-Fe2+氧化法一、 目的要求熟悉羟自由基清除能力测定的原理，掌握操作方法二、 实验原理 羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，可以发生电子转移、夺取氢原子和羟基化等反应，可以使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类都发生氧化，并损 伤膜结构及功能，在研究自由基时，反应可通过水的辐射、光解及化学反应来产 生羟自由基，Fenton反应是最常见的化学反应，Fenton反应是以过氧化氢为氧化 剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法邻二氮菲-Fe2+是一种氧化还原指示剂，其呈色变化可反映出溶液中氧化还原 状态的改变。

H2O2/Fe2+体系，通过Fenton反应所产生的羟自由基（H0・），邻二 氮菲-Fe2+水溶液可被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+，从而使邻二氮菲-Fe2+在 536nm处的最大吸收峰消失，根据吸光度的变化，可推知系统中H0・的产量Fenton 反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法， 其反应机理如下：Fe2+ +H2O2f Fe3+ +OH -+・0H羟自由基可以与抗氧化剂发生作用，由于邻二氮菲- Fe2+水溶液显橙红色根 据邻二氮菲- Fe2+颜色的变化可利用分光光度法（536nm处特征吸收峰的变化） 对抗氧化剂的抗自由基性能进行分析三、 器材与试剂（一）器材 恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光 度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等试管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温 度计、微量取样器、移液管等二）试剂邻二氮菲、H2O2、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、抗坏血酸、BHT、 乙醇等1 ）0.75mmol/L邻二氮菲溶液:取邻二氮菲（邻菲啰啉）1.487g,溶于100.00ml 无水乙醇中，使用时用重蒸水稀释 100倍2） 0.2mol/L 的磷酸盐缓冲溶液（PBS 液，pH7.4）： 0.2mol/LNa2HPO481ml ＋0.2mol/LNaH2PO4 19mlNaH2PO4 ・ 2,分子质量 156.03, 0.2 mol IL 溶液含 31.21g/L。

Na2HPO4 ・ 12,分子质量 358.22, 0. 2 mol /L 溶液含 71.64g/L3） 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液4） 0.01%H202溶液四、操作步骤（一）样品测定 将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度,然后每一浓度均进行以下实验1） 取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液1mL于试管中，依次加入PBS液2mL 和蒸馏水1mL,充分混匀后，加0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液1mL,混匀，加 0.01%H2O21mL，于37°C下温育60min,于536nm处测得其吸光度，其值为A 损伤其空白参比2mL PBS液+4mL水2） 同（1）,只有其中用1ml蒸馏水代替1ml H2O2，测得的吸光度称A未 损伤其空白参比为2mL PBS 液+4mL水3） 用提取物试样液1ml代替（1）中的1ml蒸馏水，测得的吸光度称A样 其空白参比为1mL试样液+2mL PBS液+3mL水二） 阳性对照试验 将抗坏血酸等抗氧化药品配制成梯度浓度，与提取样品一起进行抗氧化实验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力方法同样品的测定三） 注意事项测定时加样方法对结果有重要影响，须先将邻二氮菲溶液、PBS液及双蒸水 混均匀，每管加入硫酸亚铁溶液后立即混均匀，否则会使局部颜色过浓，溶液颜 色不均匀，从而影响结果的稳定性。

五、结果计算H0.清除率（d）：d%= ［（A样一A损伤）/ （A未损伤一A损伤）］X100%总的H0・的产生量：△A536=A 未损伤一 A 损伤加入样品后H0・的产生量：△A536=A 未损伤一 A 样实验三 还原力试验 实验原理［10］：还原能力的测定是以样品是否是良好的电子供应者为指标的如果样品是良好的电子供体，其供应的电子不仅可以使Fe3+还原成Fe2+,还可以 与自由基结合形成惰性的物质，从而达到中断自氧化链锁反应的目的操作过程⑴】：在15mL的离心管中依次加入pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL, 不同浓度的样品液2.5mL和1%的铁氰化钾溶液2.5mL，混合均匀后，置于50c 水浴中温育20min,然后迅速冷却（冬季：自来水，夏季：冰水浴），再加入10% 的三氯乙酸2.5mL，混匀后，在3000r/min的条件下离心分离10min后，取上清 液5mL于20mL的比色管中，再加入蒸馏水4mL和0.1 %的三氯化铁1mL，混 匀后，放置10min，在700nm处测定吸光度，吸光值越高，还原力越强参比（调零）：pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5 mL +不同浓度的样品液2.5mL+10% 的三氯乙酸2.5mL+2.5mL水清除超氧阴离子自由基的试验超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴 离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超 氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多 种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。

本研究采 用邻苯三酚自氧化法进行试验 实验原理［6］：邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生 02-・，02-・能加速 邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积 累在滞后30s〜45s与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.， 有色产物在325nm有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02「的浓度，清除 02「就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的 目的操作过程⑺:在10mL的比色管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl 缓冲液，置于25r水浴中预热20min，然后加入样品液1mL，再加入在25°C水浴 中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL （邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸 配制），混匀后在25C水浴中反应4min，立即用8mo1/L的HC1两滴终止反应， 并在325nm处测定吸光度，同时用1mL的蒸馏水代替样品液作为空白管每管 做三个重复，取平均值并且同时用 10mmol/L 的盐酸 0.3ml 代替邻苯三酚溶液 0.3mL作试剂空白空白管、样品管都要做，都要将试剂空白去除）A空——A样0 -•清除率（％） = x 100%2 A空先配制成指定浓度（50mmol/L）的Tris-HCl缓冲液，在加蒸馏水溶解时，首先加入小于计 算所得的蒸馏水体积的蒸馏水，然后用 HCl 或者 NaOH 调节 pH 至 8.2 ，最后再用蒸馏 水定容到指定体积即可。

Tris-HCI 缓冲液(0.05 mol/L)50毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与X毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100 毫升pH (25°C) X (mL)7.10 45.77.20 44.77.30 43.47.40 42.07.50 40.37.60 38.57.70 36.67.80 34.57.90 32.08.00 29.28.10 26.28.20 22.98.30 19.98.40 17.28.50 14.78.60 12.48.70 10.38.80 8.58.90 7.0Tris分子量=121.14 ； 0.1 mol/L溶液为12.114 g/LTris溶液可从空气中吸 收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严50mmol/L PH8.2 Tris-HCI缓冲液的配制：准确称取6.057g Tris样品，用蒸馏 水定容于500ml容量瓶中，即为0.1mol/L Tris溶液，取250 ml此Tris溶液，再 取114.5ml 0.01mol/L HC1溶液混合，调PH值至8.2并定容至500ml即可3mmol/L邻苯三酚溶液的配制:准确称取0.3783g邻苯三酚，用0.01mol/L HCl 溶液溶解定容至100ml,再取10ml此溶液定容至100ml即可。

0.1mol/LHCl的配制：浓盐酸10mL加水稀释至1L2.2.3.1树脂的处理方法吸附树脂生产过程中一般均采用工业级原料，产品没有经过进一步净化处理，因此，在使用树脂之前必须进行一定的处理，其预处理方法如下将各种树脂先用95%乙醇浸泡24h,使树脂充分溶胀，然后用乙醇洗至洗出 液加适量。