PCNA反义探针用于基因显像的实验研究.pdf

华中科技大学同济医学院 博士研究生毕业论文D O C T O R A T EG R A D U A T I O NT H E S I S H U S TP C N A 反义探针用于基因显像的实验研究G e n ei m a g i n gs t u d yw i t hP C N Aa n t i s e n s ep r o b e研究生姓名：张艳容导师姓名：张永学教授学科专业：影像医学与核医学指导小组成员：丛垂主教授生主盟垫盘芏旦壹匡生睦 蛊垡教授芏主i ±选盘生回注匡茎隆 吝墨墨副教授生主盘焦盘堂固叠堕茔堕 萱圉叠副教授芏生型选盘生旦壹堕生睦华中科技大学同济医学院研究生部竺±型垫查兰旦堑垦兰堕．一一—j 至兰兰壁垒薹前言分子影像( m o l e c u l a ri m a g i n g ) 是随着医学影像技术的发展，并融入了现代分子生物学和生物化学的先进成果而形成的新的研究领域，也是当今医学影像学发展与研究的最高目标t 关于分子影像学的定义，美国麻省总医院的W e i s s l e d e r 认为，分子影像学是指在活体状态下，应用影像学对细胞和分子水平的生物过程进行定性和定量研究。

也就是说，无论采用何种成像技术，只要是对发生在分子和细胞水平的生物过程改变进行成像和量化的技术都可称为分子影像现有的分子影像学技术包括核医学分子显像、磁共振分子显像、C T 分子显像以及超声分子显像，其中以核医学成像技术进行的分子核医学显像是其中最为成熟的部分【”分子核医学的研究内容主要包括以下几方面：受体显像受体显像是利用放射性核素标记的某些配体能与靶组织中某些高亲和力的受体产生特异性结合，通过显像仪器显示其功能与分布的技术应用于受体显像的分子探针主要有胆碱能受体显像剂，肾上腺能受体显像剂，多巴胺D 2 受体显像剂，以及可用于神经内分泌肿瘤分子显像的生长抑素受体显像剂1 ¨I n —o c t r e o t i d e 或o c t r e o t a t e 等⋯4 1 代谢显像在分子核医学领域中，代谢显像是目前最为成熟的技术，并已经广泛应用于临床代谢显像剂主要包括反映葡萄糖代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢和蛋白质合成以及D N A 合成的显像剂如懈F —F D G 、碳一1 1 棕榈酸、博F - F L T等其中应用最广泛的是”F - F D G F - F D G 作为葡萄糖转运体表达的～种标志物，在肿瘤的早期诊断、转移与复发的检测、疗效评介，神经、精神疾病以及脑功能研究，研究心肌细胞活性等方面具有重要的临床意义陋”j 。

乏氧显像肿瘤乏氧和肿瘤侵犯程度呈『F 相关，而和肿瘤对化疗与放疗反应呈负相关肿瘤乏氧的S P E C T 和P E T 显像剂研究主要集中在咪唑和非咪唑化合物上，经放射性核素标记后在肿瘤中经还原聚积在乏氧细胞中，以此进行显像，另外，乏氧显像剂亦可用于评价心肌细胞活力目前这方面仍停留在实验研究上G e n eI m a g i n gS t u d yw i t hP C N A A n t i s e n s eP r o b e华中科技大学同济医学院博士学位论文陋”I 放射免疫显像放射免疫显像曾引起核医学界的广泛关注，并寄托了无限希望，近年来，R I I 的研究取得了很大的进展，许多显像剂已经进入临床应用阶段例如．美国F D A 已批准有关用于结肠癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌的多种放射性标记的单克隆抗体用于显像诊断[ 2 0 - 2 5 】单克隆抗体显像存在分子量大，穿透力差、血液本底高、免疫源性等缺点，但是随着分子生物学技术的飞速发展，人们可以应用基因工程技术制各出免疫源性低、人源性高、血液清除快、组织穿透力强的小分子抗体[ 2 6 ’2 8 】，因此，R I I 在肿瘤学的研究中仍将具有良好的前景。

凋亡显像近年来的研究显示许多疾病的病理生理学过程都与绍胞凋亡密切相关一种组成阴离子膜磷酯的磷酯酰丝氨酸( P S ) ，正常局限在双层浆膜的内小叶，当细胞出现凋亡，则暴露在细胞表面在人体组织中，膜联蛋白．V ( A n n e x i n —V ) 能选择性地和细胞表面的P s 结合因此，用放射性核素标记A n n e x i n —V ，能显示体内细胞凋亡的部位和范围，从而避免多次重复创伤性活组织检查A n n e x i n —V 的放射性核素标记，目前以””T c —H Y N I C —A n n e x i n ．V 为最佳，其摄取值基本和凋亡的水平相一致[ 2 9 ．30 1 基因显像基因显像包括直接和间接基因显像直接以放射性核素标记人工合成的反义寡核苷酸，引入人体后，通过体内核酸分子杂交而与相应的靶基因结合，应用显像仪器便可以直接观察其与病变组织中过度表达的目的基因发生特异性结合的过程，定位和定量显示靶基因，这一直接的基因显像技术称为反义显像间接显示治疗基因表达程度、部位和时间的基因显像方法主要为报告基因显像报告基因是一段导入生物体内的被修饰的核苷酸系列，能够产生容易被测量的表型( 蛋白) 。

用于报告基因显像的探针主要是放射性核素标记的酶( 单纯疱疹病毒胸苷激酶) 的底物、受体( 生长抑素受体) 的配体以及能与共表达的融合蛋白结合的转螯合剂( 9 9 m W C —G H ) 等弘33 1 在上述多种分子核医学的显像方法中，以受体显像和基因显像最为成熟，而其中又以基因显像最有发展前景本研究中主要探讨以反义探针直接进行的基因显像研究在以往的反义显像研究中．最为常用的探针为针对原癌基因的核素标记反义探针，如c —m y c ‘3 4 4 ∞1 ，c ．e r B 2 ⋯，b c l 一2 [ 4 2 - 4 3 1 等此外，针对疾病发生发展过程中G e n ei m a g i n gS t u d yw i t hP C N A A n t i s e n s eP r o b e华中科技大学同济医学院博士学位论文出现的一些特征性基因表达改变，一些学者以核素标记一系列经不同修饰( 硫代磷酸化，肽核酸等) 的反义探针进行了基因显像研究N a k a m u r aK 等以针对P 一糖蛋白基因r r l R N A 的寡核苷酸探针进行了肿瘤多药耐药基因显像【4 4 45 1 T i a nx 等以针对周期素D Im R N A 的肽核酸对乳腺癌肿瘤模型进行了显像【4 6 1 。

S u z u k iT 等以神经胶质纤维酸蛋白m R N A 的肽核酸进行了脑缺血的体内显像研究【4 7 ．48 1 d eV f i e sE F 等以针对一氧化氮合成酶的反义寡核苷酸对炎症性肠病进行了显像研究【4 9 】W a I l gJ 等以调节细胞增殖的细胞周期依赖激酶抑制剂p 2 1 ( W A F ．1 ／C I P ．．1 )m R N A I 怍为目的基因对乳腺癌模型进行了显像研究【5 0 I L e eH J 等以核素标记的针对蛋氨酸m R N A 的肽核酸对舞蹈病进行了显像研究垆u 高再荣等以针对s u r v i v i n基因m R N A 的寡核苷酸探针对荷肝癌裸鼠模型进行了显像研究‘52 1 上述各种应用于反义显像的探针均能在整体水平反映发生于分子水平的病理生理学改变，其中以针对反映细胞早期增殖改变的原癌基因c ．m y c ，b c l ．2 的反义显像研究最为深入本课题组曾以针对c —m y cm R N A 的反义寡核苷酸探针对动物模型进行了体内分子显像研究，结果表明核素标记的反义c —m y c 探针能较清晰地显示病变组织m l 在此基础上，本研究试图以核素标记的针对增殖细胞核抗原( p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e u sa n t i g e n , ．P C N A ) m R N A 的反义寡核苷酸进行基因显像研究，以求得到一种新的分子显像探针。

在各种导致细胞异常增殖的复杂的网络系统中，存在原癌基因的激活、抑癌基因的失活、信使分子的表达上调、受体分子的量和结合能力的改变等等，一系列的刺激或抑制作用因素的结果将汇集于细胞周期的G o ／S 期交汇处，表现为D N A 合成增加或减低，最终表现为细胞增殖的异常活跃或抑制P C N A 是一种分子量为3 6 K D 的细胞周期相关蛋白，它的作用是作为D N A 聚合酶6 的辅因子，促进细胞自G 0 期进入S 期，加速D N A 合成，因此其表达可以直接显示细胞的增殖程度弘5 6 1 在临床上，对P C N A 的免疫组织化学染色已经成为评价异常增殖性疾病的恶性程度，反映肿瘤细胞的代谢和D N A 的合成状态的有效手段之一，其增殖活性与肿瘤细胞的分化、浸润、转移、复发和预后有密切关系，并可用于肿瘤治疗后的疗效观察另外，在肿瘤和血管增殖性疾病的反义治疗研究中，针对P C N A m R N A 的反义寡核苷酸已经显示良好的抑制细胞增殖的效果[ 5 7 ．6 1 1 G c n e I m a g i n g g m d y w l c hP C N A A a t i s e a s eP r o b e华中科技太学同济医学院博士学位论文本研究试图从细胞异常增殖的发生发展过程这样一个复杂的网络系统中寻找到一个能直接显示细胞异常增殖的靶点，因此选用了与细胞的增殖密切关连的P C N Am R N A 作为研究的靶基因，以求得到一种能直接显示疾病异常增殖的分子探针；在研究对象上，选用了肿瘤和动脉粥样硬化这两种有代表性的增殖性疾病：从寡核苷酸的标记，标记物的理化性质和生物学性质，反义探针与细胞中靶分子的特异性结合能力，反义探针在增殖旺盛的细胞中的摄取动力学，在动物体内的生物学分布特征，以及在荷肿瘤模型体内的显像等各个方面进行了研究，以探讨核素标‘} E P C N A 反义寡核苷酸能否作为一种新的分子探针用于疾病的基因显像研究。

G e n e I m a g i n gS t u d y w i t hP C N A A n t i s e n s eP r o b e4华中科技大学同济医学院博士学位论文P C N A 反义探针用于基因显像的实验研究摘要目的：以放射性核素标记针对增殖细胞核抗原( P C N A ) m R N A 的反义寡核苷酸，通过一系列体外和体内实验研究，探讨该标记物作为一种分子探针应用于反义显像研究的价值方法：分别合成一段针对P C N A m R N A 5 ’端非编码区的反义和正义寡核苷酸，在双功能螯合烈, ' s - A c e t y l - N I - I S , 一M A G 3 的螯合作用下，以9 9 ⋯T c 进行标记标记后观察标记率，放射化学纯度，标I 己物与互补寡核苷酸的结合能力，标记物在P B S和血清中的稳定性；观察该标记物在增殖旺盛的卵巢癌细胞中与靶基因特异性结合的能力和摄取动力学，研究标记物在正常昆明小鼠体内的生物学分布，并对荷卵巢癌裸鼠进行显像；研究标记物在增殖旺盛的血管平滑肌细胞中与目的基因特异性结合的能力和摄取动力学1 ．寡核苷酸的偶联和标记人工合成一段针对P C N Am R N A 5 ’端非编码区的含1 8 个碱基的反义寡核苷酸( 序列：57 ．G A T C A G G C G T G C C T C A A A 一37 ) ，相应的正义链( 序列：5 ’- T T ] 、G A GG C A C G C C T G A T C 一3 ’) 合成后用于对照实验。

在相同条件下分别对正义和反义寡核苷酸进行偶联和标记在一定条件下，寡核菅酸与N H S —M A G 3 发生偶联反应，以O ．7 x 2 8 c mS e p h a d e xG 2 5 凝胶柱分离偶联和游离的核酸随后以””T c 对偶联物进行标记，以O ．7 x 2 8 e mS e p h a d e xG 2 5 凝胶层析柱对标记产物进行标记率的分析，以反相S。