BCA方法测定骨骼肌蛋白质浓度解读.docx

BCA方法测定骨骼肌蛋白质浓度一、 原理BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一 起即成为苹果绿，即BCA工作试剂在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋 白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果 绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比二、 操作1. 配Working reagent工作液:设需测样品为N个，则总共需要Working Reagent的 ul 数=(9+N) x2x200ul ；(双管做)2. 将试剂A和试剂B按照50:1的比例配成Working Reagent； 3.采用ELISA酶 标比色板4. 9个标准品不同浓度溶液配制如表1蛋白浓度分别为 Opg/ml，25yg/ml，125yg/ml，250yg/ml，500yg/ml，750 yg/ml， 1000 pg/ml， 1500 pg/ml， 2000 yg/ml采用 0.5 试管表1 BCA蛋白标准品浓度配置表A B C D E F G H I (空白)96孔酶标板13LHCFEDCA韵IHGFEDCAPBS (ul)0 25 65 35 65 65 65 80 60BCA标准品(ul)60 75 65 35 (B) 65 (C) 65 (E) 65 (F) 20 (G)终浓度(ug/ml)2000 1500 1000 750 500 250 125 25 04■51HGFEDCA测61HGFE□CBA测785. I-A各加10ul不同浓度BCA标准品溶液；6. 测定样品，各加8ul PBS和2ul蛋白样品（相当于提取的样品稀释5倍）；7. 2-8排各加200ul工作液；8. 封口胶盖好酶标板，9. 37度孵育30分钟；10•酶标板冷却至室温；11. 酶标仪（BIO-RAD 680） 570nm波长，读取每孔OD；12. 由自带分析软件绘制标准曲线和浓度分析；13蛋白样品终浓度（ug/ul）=待测样品浓度（ug/ml） x稀释的倍数5-1000 酶标仪使用1•开机计算机密码：1234酶标仪密码：000002. 参数设置微板模板设置---模板编号：zhangliu模板名称：2011-03-13 （日期）定义微孔：空白---标准---样品保存3. 检测方法（1） 终点法---找模板编号zhangliu---建微板---选测定项目（看波长是否合适）--- -读定结果（导出WORD保存）---吸光度值（即减去空白的OD,导出WORD保 存）（2） 浓度分析---维护标准品---输入标准品浓度---线性曲线---拟合---关页面（3） 计算浓度---浓度报告---保存数据。

带优盘） 共6大组每大组4小组每小组4人，4人分两组（4人1块板，四条标准曲线，1组标准管）2-10ul、200ul 枪各 8 把；100ul 枪 4 把取---原始测。