拉曼光谱法检测果蔬中的类胡萝卜素.docx

拉曼光谱法检测果蔬中的类胡萝卜素一、 实验目的1. 熟练掌握拉曼光谱分析法的原理及应用2. 利用拉曼光谱法和RP-HPLC法检测果蔬中的类胡萝卜素二、 设计思想与实验原理类胡萝卜素是自然界广泛存在的一类天然色素的总称，包括胡萝卜素和叶黄素两大类 类胡萝卜素具有多种生物活性，它们广泛存在于微生物、植物、动物及人体内，是生物体必 不可少的组成成分常见的有虾青素、0-胡萝卜素、番茄红素、角黄素、玉米黄素等［1］已明确结构的类胡萝卜素有600余种，其中由8个类异戊二烯组成，碳原子数为40的 四萜占多数类胡萝卜素具有活泼共轭双键体系，有特征的紫外可见光吸收和拉曼响应类胡萝卜素具有重要的生物学功能，作为强抗氧化剂，能高效猝灭单线态氧；参与执行 光能传递和物质转化、抗光敏化作用，是光合生物必不可少的组分；此外，它们对人类有重 要的保健防病功能，如清除自由基、免疫调节、防治眼病、抑制肿瘤或抗癌等但是直到现 在，人们对类胡萝卜素的生物学功能和机理并未完全了解为了能在类胡萝卜素研究中获得 可靠和有价值的结论，测定类胡萝卜素组成，获得可靠的资料变得非常必要［1,2J通过文献调研，我们了解到目前检测类胡萝卜素的方法主要有反相液相色谱法 （RP-HPLC法）和拉曼光谱法两种。

本实验将采用两种方法来检测胡萝卜中的类胡萝卜素一）RP-HPLC 法反相液相色谱法是检测类胡萝卜素的常用方法，包括提取、皂化和分离检测三个部分， 该法能够实现对类胡萝卜素各组分的分离和准确定量自然条件下，类胡萝卜素通常与糖、蛋白质等呈结合态的形式，所以首先需要对其进行 提取文献报道的提取方法有有机溶剂提取法［3］、酶反应法［4］、微波辅助提取法［2］、超声波 辅助提取法［3］、超临界流体萃取法⑷等，本实验选用条件较为简单的有机溶剂提取法根据 文献数据［3, 5］，实验选取正己烷、乙醇（体积比2： 1）作萃取剂由于类胡萝卜素主要以脂肪酸酯的形式存在，需要在碱性条件下，对上述提取液进行皂 化，待脂肪酸释放，再用有机溶剂萃取根据文献⑻报道，室温下在200g/L KOH溶液中搅 拌皂化过夜，再用乙酸乙酯萃取即可反相液相色谱是目前用得较为广泛的一种类胡萝卜素的分析方法，具有分离效率高、分 析速度快、样品用量少等优点在目前类胡萝卜素的RP-HPLC测定中，其定性定量工作主 要根时间、紫外-可见特征吸收光谱以及所添加标准品的共洗脱来完成［7］本实验以胡萝卜 醛为标准样品，选用的色谱条件［7,8,⑵：色谱柱：C18 analytical column （LiChroCAET， LiChm spher 250-4）；柱温：30°C ；流速：0.7 ml/L；二极管阵列（DAD）检测器；紫外检测波长： 475nm；流动相：乙月青：甲醇：二氯甲烷（体积比60： 35： 5）。

此外，胡萝卜素随温度的升高分解速度加快、随时间延长保存率变低，且光照使胡萝卜 素发生明显的降解，因此胡萝卜素需在低温、避光的惰性气氛中保存，必要时可添加抗氧化 剂【2, 7］二）拉曼光谱法人们对类胡萝卜素研究主要集中在其生物学功能，色谱法对于其定性定量研究虽然很重 要，但是毕竟离开了活体环境，与实际过程多有不符；其次，类胡萝卜素绝对浓度比较低， 色谱法中引入干扰较大，且类胡萝卜素结构很不稳定，在分离过程中有较多改变所以，在 类胡萝卜素的生理功能研究中，高效液相色谱法有较大缺陷［14,16］ 0类胡萝卜素具有独特的链式结构，含有长的共轭双键，比较容易引起分子极化率的变化， 因此较适合用激光拉曼光谱法进行检测传统的拉曼光谱信号弱，灵敏度低，早期仪器中的 过高的激光功率会损伤活体植物，这些都限制了它的应用但是共振拉曼光谱、显微拉曼技 术等新方法的出现使得用拉曼光谱活体原位检测果蔬中的类胡萝卜素成为可能激光共振拉曼光谱（RRS）是产生的激光频率与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合 时，这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度可达到正常拉曼谱带的104-106倍，并观察到 正常拉曼效应中难以出现的、其强度可与基频相比拟的泛音及组合振动光谱14］。

显微拉曼光谱技术是将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来的一种应用技术利 用显微拉曼技术，可以快速无损对果蔬进行检测［15］由于类胡萝卜素的吸收光谱位于蓝绿光波段，中心波长为440 nm,吸收峰在450 nm附 近，其谱宽约为100nm根据文献值，本实验利用473 nm激光激发类胡萝卜素，可以得到 拉曼光谱［15］三、 实验主要仪器与试剂实验仪器：打浆机，高效液相色谱仪，减压旋蒸仪，圆底瓶（100 mL），分液漏斗（250 mL），烧杯（150 mL），锥形瓶（100 mL），棕色瓶，激光拉曼光谱仪实验试剂：胡萝卜样品，正己烷（AR），乙醇（AR），乙酸乙酯（AR），氢氧化钾（AR），乙 月青（SP），甲醇（SP），二氯甲烷（SP），胡萝卜醛（SP）四、 实验步骤（一） 高效液相色谱法1. 样品的提取取10g胡萝卜样品打浆，加入30 mL正己烷、乙醇（体积比2： 1）萃取液，于30°C以 下避光浸提数次，合并提取液，减压蒸馏2. 粗品的皂化在上述粗品中加入200g/L KOH 40mL，在室温下搅拌过夜，用25 mL乙酸乙酯抽提类 胡萝卜素数次，合并萃取液并减压旋干3. 类胡萝卜素的纯化、定量取适量上述产品，制成10-6g/mL乙青的溶液，同时准确制备1.0*10-6g/mL胡萝卜醛的 乙青溶液。

将两溶液等体积混合，充分混合，取10uL混合液进样，以乙青、甲醇、二氯甲 烷（体积比12:7:1）为流动相，分离出各种类型的类胡萝卜素并通过图谱确定各成分及其 含量二） 拉曼光谱法直接将胡萝卜样品放到拉曼仪载物台上，以473nm波长的光激发，扫描拉曼图谱对 所得谱图进行辨认和分析五、 预期实验困难a、 样品处理时，类胡萝卜素可能发生氧化、降解，应加快实验操作，在温度较低、光 线较暗的环境下进行；b、 由于胡萝卜细胞壁没有破坏，直接萃取色素的效率可能不高，应加速搅拌、多次萃 取，可考虑先使用酶水解细胞壁再萃取；c、 萃取液中可能仍有较多杂质，对RP-HPLC纯化、定量带来不利影响，可先进行柱 层析，再使用高效液相色谱柱层析参考方案[12]用硅胶预装成2 cmX50 cm的层析柱，将类胡萝卜素萃取物用少量正己烷溶解后倾倒于 柱上，用石油醚：苯(体积比9： 1)作洗脱剂，进行洗脱，收集橙红色的条带，得到较纯净的 类胡萝卜素d、 活体植物中参与拉曼散射的活性物质较多，谱图分析困难果蔬中类胡萝卜素浓度 较低，仪器对较弱的拉曼信号收集效率不高，灵敏度不够要想获得更为精确的结果，需要 做较多次的摸索。

六、 实验预期与展望本次实验通过RP-HPLC法和拉曼光谱法检测胡萝卜中的类胡萝卜素含量情况，前者可获 得样品中各成分组成及其含量，后者检测类胡萝卜素的总量RP-HPLC法是较标准的方法， 优势在于准确的组分定量，但操作过程长，有赖于快速熟练的操作；拉曼光谱法是新近发展 的方法，原位、无损的检测使得操作简便，无需样品前处理，但只能获得类胡萝卜素总量寻求原位、无损、准确定性、定量的检测方法一直是研究者的目标，如近也AD的应用 可简化类胡萝卜素测定操作拉曼光谱法是一种应用前景广阔的方法，其灵敏度和分辨率必 将取得进一步发展，实现类胡萝卜素各组分检测也将成为可能，对于动植物生长、人类疾病 等的深入研究有重大意义七、 参考文献[1]张岩岩，陈玉超.类胡萝卜素的研究进展.硅谷2009(02).⑵赵功玲，娄天军.酶法提取番茄红素的工艺研究.食品工业科技,2003(4):60-61.[3] Weissenberg M, Schaeffler, Menagem E, et a1. Isocratic non-aqueous reversed-phase high-performance liquid chromatographic separation of capsanthin and capsombin in red peppers, paprika and oleoresin. Journal of Chromatography A,1997,757(1):89-95.[4] 薛伟明，张效林，亢茂德等.红花黄色素的酶法提取应用研究.化学工程,1999,27(1):42-50.[5] 李洋,徐雅琴.超声波法提取沙棘类胡萝卜素条件的优化.食品科技,2008(1):137-139.[6] 赵永彬.胡萝卜渣的干燥方式及其类胡萝卜素提取工艺研究.陕西杨凌:西北农林科技大 学,2005.[7] 胡建中.华中农业大学硕士学位论文.柑橘中类胡萝卜素的提取、分离、鉴定及其稳定性 研究.[8] 卢红梅，梁逸曾.高效液相色谱法测定食物中的类胡萝卜素.色谱.2005,1,23(1):57-62.[9] 李媛媛，高彦祥.膜分离技术纯化栀子黄色素的研究.食品科学,2006,27(6):113-117.[10] 刘敬业，丘玲，王亮.薄层色谱分离测定烤烟中的0-胡萝卜素.昆明师范号科学校:自然科学 版,1998,13(1):1-3.[11] 娄天军,赵功玲，张炎等.柱层析法纯化番茄红素的研究.食品研究与开发,2005, 26(4):28-29.[12] 徐响，刘光敏,王琦等.反相HPLC法测定沙棘果油中类胡萝卜素.食品工业科技,2007, 28(12):206-207.[13] ZHANG Liang, YUAN E-nuo, TAO Guan-jun et al. Isolation and Determination of A New Carotenoid. Nat Prod Res Dev. 2006,18:737-740.[14] 伍林，欧阳兆辉等.拉曼光谱技术的应用及研究进展.光散射学报,2005,(02).[15] 赵金涛，张鹏翔,徐存英.活体植物中0-胡萝卜素分子的二级拉曼散射谱.光谱学与光谱分 析,2002,(05).[16] 郭红卫，黄丽，黄竹颖等.运用共振拉曼散射光谱法测定皮肤类胡萝卜素.环境与职业医 学,2006,(03).。