酶催化蔗糖转化反应.docx

实验一 酶催化蔗糖转化反应（~28 学时）一、目的和要求1．用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定2．了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定3．学会米氏常数的测定二、实验原理 蔗糖转化反应 蔗糖+水 > 葡萄糖+果糖这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行蔗糖及其转化产物都有不对称的碳 原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度 的变化来描述反应进程溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品 管的长度等均有关系当其他条件不变时，旋光度u与反应物浓度C成线形关系，即a=kC作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为 66.6；生成物的葡萄糖也是右旋性的物 质，其比旋光度为 52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为－91.9由于生成物中果糖 左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质因此，随着反应的进行，体系的右旋 角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完 全转化，这时体系的左旋角达到最大值三、仪器和试剂旋光仪1台恒温槽 1 套 葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯） 醋酸－醋酸钠缓冲溶液四、实验步骤1．蔗糖酶的提取取鲜酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，搅拌15〜20分钟后使团块液化， 再加3 mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37°C保温60小时左右。

取出后加入 3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右将混合物以每分钟3000转的速度离心30 分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，再以同样速度离心30 分钟，所得澄清的黄色液 体即为蔗糖酶粗品将此蔗糖酶用pH=4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存2．作蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线 根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的 旋光度的工作曲线例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是 制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗 糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关， 经过线性拟合，其直线方程为：y=—60.28x+a其中 x—蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M）y—蔗糖转化进程中体系的旋光度值a—不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算 a=66.6XLXC （L=10cm, C 是蔗糖浓度 g/mL）通过上述的直线方程，可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值，求出其转化成葡萄 糖的浓度x,从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度。

3． 酶比活性的测定配制2.5%的蔗糖溶液100 mL,测定其旋光度在20°C的条件下加入蔗糖酶5 mL,反 应3分钟测定体系旋光度值y,用公式y=—60.28x+a求出葡萄糖浓度x,及生成葡萄糖 的毫克数,即可求出酶的比活性上述方法制备的酶,其活性约每毫升20单位比活性（单位/mL）=（生成葡萄糖的毫克数）/（酶的体积）4．蔗糖酶进程曲线的制作取200 mL 0.1 M的蔗糖溶液，在35C水浴条件下恒温，加10 mL蔗糖酶溶液，每5分 钟取出20 mL反应液加5滴5 M NaOH灭活后，测定一次体系的旋光度求出葡萄糖的浓 度,用葡萄糖的浓度对时间作图,得到蔗糖酶催化反应的进程曲线时间（分）510152025303540旋光度葡萄糖浓度5． 蔗糖酶米氏常数的测定用缓冲溶液稀释0.5 M的蔗糖溶液成为一系列不同浓度的蔗糖溶液各50 mL,在35C恒 温条件下加入10 mL已知活性的蔗糖酶，反应5分钟，加入1 mL 5 M NaOH溶液终止反应, 测定此时溶液的旋光度，从而求出葡萄糖的生成速度V,根据米氏方程V 二-K （V） + Vm S max用反应速度V对（V/S）作图，直线的斜率-K，直线的截距为V ，从而可以求出米m max氏常数 Km。

m加入蔗糖 体积（mL）蔗糖浓度（M）起始 旋光度结束 旋光度葡萄糖 浓度（M）反应速度V（M/分）V/S11.200.0123.600.0337.200.06410.80.09514.40.12618.00.15721.60.18825.20.21五、数据处理1．利用(3)中的数据计算酶的比活性2．利用(4)中的数据作酶催化反应进程曲线3．利用(5)中的数据计算蔗糖酶米氏常数六、参考文献[1] 沈同等，“生物化学”，上册，人民教育出版社，1980 年版[2] 复旦大学，“物理化学实验”，上册，人民教育出版社，1979 年版[3] 朱俭等，“生物化学实验”，上海科技出版社，1981 年版附录一 直线直线方程一般可表示为：y=a+bx (1)式中y和x为由实验数据可确定的量；a和b为待定参数或函数例如，对Arrhenius 公式指数式，y和x分别为Ink和1/T； a和b分别为lnA和(一E/k)对式[1 nr=lnk+nlnC], y和x分别为lnr和1nC； a和b分别为lnk和n由于有实验误差，用n对由实验确定的yi与片值作y对x图时，一般说来，所得各点 并不严格的在同一直线上，于是存在着这样的问题：应如何更合理地作出直线，从而更准确 地求解 a 和 b 的值？应当指出，若直线选择不当(直线位置画的不当)，不大的偏离，将可 能导致a和b重大偏差。

尤其是当试验测定的x区间范围相对较小时，外推至x=0，将可 使截距a产生较大的误差例如依Arrhenius对数式以lnk对1/T作图，由实验测定的温度范围外推至1/T=0，即 时，所选的直线斜率的较小的偏差将会引起截距lnA产生很大的偏差，致使指前因子 A 产生更大的偏差怎样方能使直线位置选择(画)的得当呢？通俗地说，实测点y.~x.)应均匀分布在直 ii线两侧严格的说，可采用下述“最小二乘法”确定最佳a、b值，作出最佳直线若取得的数据实验值y.与x. (i=1、2、・・・n), —般来说，y.与a+bx.值并不相等，令其 误差为•则 '' 1i8.=y. —a—bx.线性回归，要求适当选择a与b之值，使各对元数据的偏差5之平方和之值为最小即.S =工(52 =工(y - a -bx )2. . .i=l i=lH=-2Z(yi- a - bxi)=0i=12)OSdb2工(y - a - bx )x = 0i i ii=13)式中y.、bx.均为已知值令y与x分别为y.与x.的平均值y =-工 yn.i =1— 1 y-nx =—乙 xnii=1则式(2)、(3)联立，可得a = y — bx (4)Y (x - x)(y - y) ii b = i (5)乙(x — X)2ii=1由式(4)、(5)确定的a和b,称之为线性回归系数。

用线性回归系数确定的直线方程y=a+bx,称为回归直线方程其对应的直线，称为回归直线回归直线有下列性质1. 当x= x时，由式(1)、(5)可知y= y，即回归直线必通过(y, x )点2. 由式(2)知，回归直线要求y的各次实验值yi与计算值a+bxi偏差之总和为零，即各 实验点均匀分布于回归直线的两侧欲度量一组实测点与回归直线的相符程度，常引用所谓的相关系数“丫”作为定量指标， 其定义为：工(x — x )(y — y )i i i iY= Y (6)'、乙(x — x )2 Y(y — y )2ii iii i当1丫1值在0〜1之间，1丫1值越接近于1,表明该组实测点与回归直线吻合性越好当丫1=1 时，表示所有的实测点均严格地落在回归直线上；1丫1<0.482，则该组x、y间线性关系不明 显，此时推求回归直线方程已无意义了较精密的小型计算器一般配有直线方程的回归计算标准程序，使用十分方便附录二 酶催化反应一、酶酶与其他催化剂不同，能在机体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，使生物体内 的各种物质处于不断的新陈代谢之中所以说，酶在生物体的生命活动中占有极为重要的地 位，研究酶的化学性质及其作用机理，对于人们了解生命活动的规律，从而进一步指导有关 的医学实践及工农业生产具有重大意义。

酶的本质是蛋白质，酶是具有催化作用的蛋白质酶蛋白主要由氨基酸组成，同其他蛋 白质一样，具有两性电解质的性质，并具有一、二、三、四级结构，也受热、紫外线照射等 物理因素及酸、碱、有机溶剂等化学因素的影响而变性或沉淀，丧失酶活性酶的分子量也 很大，其水溶液具有亲水胶体的性质，不能透析在体外，酶能被胰蛋白酶等水解而失活根据酶的组成，酶可以分成简单蛋白质和结合蛋白质两类脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂 肪酶、核糖核酸酶等属于简单蛋白质，其活性仅仅取决于它的蛋白质结构；另一类酶，其中的蛋白质部分——酶蛋白不具有活性，需要加入非蛋白的组分——辅助因子后，才表现出酶 的活性，这就是结合蛋白质酶蛋白与辅助因子结合后形成的复合物称为全酶例如酪氨酸 酶就是以Cu+或Cu2+为辅助因子的全酶在催化反应中，酶蛋白与辅助因子所起的作用不同， 酶反应的专一性及高效率取决于酶蛋白本身，而辅助因子则直接对电子、原子或某些化学基 团起传递作用酶的辅助因子包括金属离子（Zn+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+等）及小 分子复杂有机化合物它们本身无催化作用，但参与氧化还原或运载酰基载体的作用在大 多数情况下，可以通过透析等方法将全酶中的辅助因子除去，这种与酶蛋白分子松弛结合的 辅助因子称为辅酶。

在少数情况下，有一些辅助因子以共价键和酶蛋白较牢固地结合在一起， 难以透析除去，这种辅助因子称之为辅基细胞色素氧化酶与铁卟啉辅基就结合的比较牢固 酶母提取物经透析除去辅酶I（Co I）后，便失去了催化葡萄糖发酵的能力根据酶蛋白分子的特点可将酶分为单体酶、寡聚酶和多酶体系单体酶只有一个多肽链， 分子量在 1.3 万到 3.5 万之间，一般是催化水解反应的多肽链寡聚酶由几个甚至几十个亚 基组成，亚基之间不是共价键结合，彼此很容易分开，分子量从3.5 万到几百万，如磷酸化 酶a多酶体系是由几种酶彼此嵌合形成的复合体多酶复合体的分子量一般都在几百万以 上，它有利于一系列反应的连续进行，如在脂肪酸合成中的脂肪酶合成酶复合体在酶促反应中被酶作用的物质称为酶的底物 根据酶促反应的性质可将酶分为六大类：1.氧化还原酶类一一催化氧化还原反应A ・ 2H+B A+B ・ 2H例如黄嘌吟:氧化还原酶（习惯称为黄嘌吟氧化酶）2.移换酶类一一催化功能基团的转移反应AB+C A+BC例如丙氨酸:酮戊二酸转移酶（习惯称为谷丙转氨酶或丙氨酸氨基转移酶）COOH COOHch3 ch2I , I 谷丙转氨酶H—C—NH2 + CH2 h 二COOH C=OCOOHCH3C=O +COOH H2HC——丙氨酸酮戊二酸丙酮酸—C—NH?。