第三章培养基的配制与灭菌.ppt

第三章第三章 培养基的配制及培养基的配制及灭灭菌菌一、培养基及其作用：一、培养基及其作用：是向植物是向植物细细胞提供胞提供营营养养的的场场所其作用是向植物所其作用是向植物细细胞提供所需的各种胞提供所需的各种营营养；养；调节调节渗透渗透压压、酸碱度；供、酸碱度；供给给水分固体水分固体培养基培养基还还起着支撑作用起着支撑作用编辑课件培养基多以命名人的名字命名培养基多以命名人的名字命名目前，比目前，比较较流行的培养基有：流行的培养基有：vMS培养基，其特点是无机培养基，其特点是无机盐盐和离子和离子浓浓度度较较高；高；vB5培养基，其特点是含有培养基，其特点是含有较较低的低的铵铵；；vWhite培养基，其特点是无机培养基，其特点是无机盐盐低，适于生根；低，适于生根；vN6培养基，其特点是培养基，其特点是KNO3和和(NH4)2SO4含量含量较较高，适于花高，适于花药药培养；培养；vKM－－8P培养基，其特点是有机成分培养基，其特点是有机成分较较多，适于原生多，适于原生质质体培体培养 编辑课件二、培养基的成分：二、培养基的成分：主要可以分水、主要可以分水、 无机无机盐盐、有、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类类。

编辑课件1、水：、水：植物原生植物原生质质体的体的组组成成分，代成成分，代谢过谢过程的介程的介质质和溶媒 大大规规模生模生产时产时可用自来水但在少量研究上尽量用蒸可用自来水但在少量研究上尽量用蒸馏馏水，水，防止防止贮贮藏藏过过程程发发霉霉变质变质２、无机元素：２、无机元素：大量元素，指大量元素，指浓浓度大于度大于0.5mmol/l的元素，有的元素，有N、、P、、K、、Ca、、Mg、、S等其作用是：等其作用是：(1) 氮：氮：是蛋白是蛋白质质、、酶酶、叶、叶绿绿素、素、维维生素、核酸、磷脂、生物碱生素、核酸、磷脂、生物碱等的等的组组成成分供成成分供应应的氮化物有硝酸的氮化物有硝酸铵铵、硫酸、硫酸铵铵、硝酸、硝酸钾钾等有有时时，也添加氨基酸来，也添加氨基酸来补补充氮素 (2) 磷：磷：是生物膜、核苷酸（是生物膜、核苷酸（ 如如ATP）、核酸的重要）、核酸的重要组组成部分常用于培养基的磷化物有Ｋ常用于培养基的磷化物有ＫH2PO4或Ｎ或ＮaH2PO4等编辑课件(3) 钾钾：：ＫＫ对对碳水化合物合成、碳水化合物合成、转转移、以及氮素代移、以及氮素代谢谢等有密切关等有密切关系制备备培养基培养基时时，常以，常以KCl、、KNO3等等盐类盐类提供。

提供4) Mg、、S和和Ca：： Mg是叶是叶绿绿素的素的组组成成分，又是激成成分，又是激酶酶的活化的活化剂剂；； S是含是含S蛋白蛋白质质的的组组成成分它成成分它们们常以常以MgSO4·7H2O提供 Ca是构成是构成细细胞壁的一种成分，胞壁的一种成分，Ca对细对细胞分裂、保胞分裂、保护质护质膜不膜不受破坏有受破坏有显显著作用，常以著作用，常以CaCl2·2H2O提供编辑课件(5) 微量元素：微量元素：指小于指小于0.5mmol/l的元素，的元素，Fe、、B、、Mn、、Cu、、Mo、、Co等Fe是一些氧化是一些氧化酶酶、、细细胞色素氧化胞色素氧化酶酶、、过过氧化氧化氢氢酶酶等的等的组组成成分在制做培养基成成分在制做培养基时时常用常用FeSO4·7H2O和Ｎ和Ｎa2-EDTA结结合成螯合物使用合成螯合物使用B、、Mn、、Zn、、Cu、、Mo、、Co等，也是植物等，也是植物组织组织培养中不培养中不可缺少的元素，缺少可缺少的元素，缺少这这些物些物质质会会导导致生致生长长，分裂异常分裂异常编辑课件 这这些整株植物生些整株植物生长长所必需的所必需的营营养元素，养元素，对对于植物于植物组织组织培养来培养来说说也是必需的。

当某些也是必需的当某些营营养元素供养元素供应应不足不足时时，愈，愈伤组织伤组织表表现现出一定的缺素症状如出一定的缺素症状如缺氮，缺氮，会表会表现现出一种花色素苷的出一种花色素苷的颜颜色，不能形成色，不能形成导导管；管；缺缺铁铁，，细细胞停止分裂；胞停止分裂；缺硫，缺硫，表表现现出非常明出非常明显显的褪的褪绿绿；；缺缺锰锰或或钼钼，，则则影响影响细细胞的伸胞的伸长长编辑课件3、有机化合物：、有机化合物：培养基中若只含有大量元素与微量元培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称素，常称为为基本培养基基本培养基为为不同的培养目的往往要加不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生入一些有机物以利于快速生长长常加入的有机成分主常加入的有机成分主要有以下几要有以下几类类：：(1) 碳水化合物：碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是是较较好的碳源，可支持好的碳源，可支持许许多多组织组织很好的生很好的生长长 编辑课件(2) 维维生素生素(Vitamin)：：维维生素生素类类化合物在植物化合物在植物细细胞里主要是以胞里主要是以各种各种辅辅酶酶的形式参与多的形式参与多项项代代谢谢活活动动，，对对生生长长、分化等有很好、分化等有很好的促的促进进作用。

主要有：作用主要有： VB1 (盐盐酸硫胺素酸硫胺素)：：对对愈愈伤组织伤组织的的产产生和生活力有重要作用生和生活力有重要作用 VB6(盐盐酸吡哆醇酸吡哆醇)：：能促能促进进根的生根的生长长 VPP(烟酸烟酸)：：与植物代与植物代谢谢和胚的和胚的发发育有一定关系育有一定关系 VC(抗坏血酸抗坏血酸)：：有防止有防止组织变组织变褐的作用褐的作用 编辑课件(3) 肌醇：肌醇：又叫又叫环环己六醇，在糖己六醇，在糖类类的相互的相互转转化中起重要化中起重要作用用于构建作用用于构建细细胞壁使用肌醇能促胞壁使用肌醇能促进进愈愈伤组织伤组织的生的生长长以及胚状体和芽的形成以及胚状体和芽的形成对组织对组织和和细细胞的繁胞的繁殖、殖、 分化有促分化有促进进作用4) 氨基酸：氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被是很好的有机氮源，可直接被细细胞吸收利胞吸收利用培养基中常用甘氨酸培养基中常用甘氨酸有时时用水解乳蛋白或水用水解乳蛋白或水解酪蛋白，由于它解酪蛋白，由于它们营们营养丰富，极易引起养丰富，极易引起污污染如在培养中无特在培养中无特别别需要，以不用需要，以不用为为宜编辑课件(5) 天然复合物：天然复合物：其成分比其成分比较较复复杂杂，大多含氨基酸、激素、，大多含氨基酸、激素、酶酶等一些复等一些复杂杂化合物。

它化合物它对细对细胞和胞和组织组织的增殖与分化的增殖与分化有明有明显显的促的促进进作用①①椰乳：椰乳：它在愈它在愈伤组织伤组织和和细细胞培养中有促胞培养中有促进进作用作用②②香蕉：香蕉：主要在主要在兰兰花的花的组织组织培养中培养中应应用，用，对发对发育有促育有促进进作用③③马铃马铃薯：薯：添加后可得到健壮的植株添加后可得到健壮的植株④④水解酪蛋白：水解酪蛋白：为为蛋白蛋白质质的水解物，主要成分的水解物，主要成分为为氨基酸⑤⑤其它：其它：酵母提取液、麦芽提取液等酵母提取液、麦芽提取液等编辑课件4、植物激素：、植物激素：在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键键物物质质，， 对对植物植物组织组织培养起着决定性作用培养起着决定性作用1) 生生长长素素类类：：在在组织组织培养中，生培养中，生长长素主要被用于素主要被用于诱导诱导愈愈伤组织伤组织形成，形成，诱导诱导根的分化和促根的分化和促进细进细胞分裂、伸胞分裂、伸长长生生长长 IAA(吲哚吲哚乙酸乙酸)是天然存在的生是天然存在的生长长素，亦可人工合成，其素，亦可人工合成，其活力活力较较低低,是生是生长长素中活力最弱的激素，素中活力最弱的激素， 对对器官形成的副作器官形成的副作用小，高温高用小，高温高压压易被破坏，也易被易被破坏，也易被细细胞中的胞中的IAA分解分解酶酶降解，降解，受光也易分解。

受光也易分解编辑课件 NAA(萘萘乙酸乙酸) 在在组织组织培养中的起培养中的起动动能力要比能力要比IAA高高出出3～～4倍，且由于可大批量人工合成，倍，且由于可大批量人工合成， 耐高温高耐高温高压压，，不易被分解破坏，所以不易被分解破坏，所以应应用用较较普遍 IBA(吲哚吲哚丁酸丁酸)是促是促进发进发根能力根能力较较强强的生的生长调节长调节物物质质 2,4-D（（2,4－二－二氯氯苯氧乙酸）苯氧乙酸）起起动动能力比能力比IAA高高10倍，特倍，特别别在促在促进进愈愈伤组织伤组织的形成上活力最高，的形成上活力最高， 但它但它强强烈抑制芽的形成，影响器官的烈抑制芽的形成，影响器官的发发育编辑课件 生生长长素配制素配制时时可先用少量可先用少量95％酒精助溶％酒精助溶2, 4-D可用可用0.1mol/l的的NaOH或或KOH助溶生长长素常配成素常配成1mg/ml的溶液的溶液贮贮于冰箱中于冰箱中备备用编辑课件(2) 赤霉素赤霉素(GA)：：培养基中添加的是培养基中添加的是GA3，主要用于刺，主要用于刺激在培养中形成的不定胚激在培养中形成的不定胚发发育成小植株，促育成小植株，促进进幼苗茎幼苗茎的伸的伸长长生生长长。

一般在器官形成后，添加赤霉素可促一般在器官形成后，添加赤霉素可促进进器官或胚状体的生器官或胚状体的生长长 赤霉素溶于酒精，配制赤霉素溶于酒精，配制时时少量可用少量可用95％酒精助溶％酒精助溶赤霉素不耐赤霉素不耐热热，高，高压灭压灭菌后将有菌后将有70～～100％失效，％失效，应应当采用当采用过滤灭过滤灭菌法加入菌法加入编辑课件(3) 细细胞分裂素胞分裂素类类：： 这类这类激素是腺激素是腺嘌嘌呤的衍生物，包括呤的衍生物，包括6-BA(6－－苄苄基氨基基氨基嘌嘌呤呤)、、Kt(激激动动素素)、、ZT(玉米素玉米素)等其中其中ZT活性最活性最强强，但非常昂，但非常昂贵贵常用的是常用的是6-BA　　 在培养基中添加在培养基中添加细细胞分裂素有三个作用：胞分裂素有三个作用：①① 诱导诱导芽的分化促芽的分化促进侧进侧芽萌芽萌发发生生长长②② 促促进细进细胞分裂与胞分裂与扩扩大③③ 抑制根的分化抑制根的分化 因此，因此，细细胞分裂素多用于胞分裂素多用于诱导诱导不定芽的分化、茎、苗不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养的增殖，而避免在生根培养时时使用编辑课件5、培养材料的支持物、培养材料的支持物(1) 琼琼脂：脂：在固体培养在固体培养时琼时琼脂是最好的固化脂是最好的固化剂剂。

固体培养固体培养基利于基利于组织组织置于培养基表面置于培养基表面琼琼脂是一种由海藻中提取脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营营养2) 其它：其它：有玻璃有玻璃纤维纤维、、滤纸桥滤纸桥、海、海绵绵等，等，总总的要求是排的要求是排出的有害物出的有害物质对质对培养材料没有影响或影响培养材料没有影响或影响较较小 编辑课件６、抗生物６、抗生物质质：：抗生物抗生物质质有青霉素、有青霉素、链链霉素、霉素、庆庆大霉素等，大霉素等，用量在用量在5～～20mg/l之之间间添加抗生物添加抗生物质质可防止菌可防止菌类污类污染 7、抗氧化物：、抗氧化物：植物植物组织组织在切割在切割时时会溢泌一些酚会溢泌一些酚类类物物质质，，接触空气中的氧气后，自接触空气中的氧气后，自动动氧化或由氧化或由酶酶类类催化氧化催化氧化为为相相应应的的醌类醌类，，产产生可生可见见的茶色、褐色以致黑色，的茶色、褐色以致黑色，这这就是酚就是酚污污染这这些物些物质质渗出渗出细细胞外就造成自身中毒，使培养的胞外就造成自身中毒，使培养的材料生材料生长长停停顿顿，失去分化能力，最，失去分化能力，最终变终变褐死亡。

褐死亡 编辑课件v抗酚抗酚类类氧化常用的氧化常用的药剂药剂有半胱氨酸及有半胱氨酸及Vc，可用，可用50～～200mg/l的的浓浓度洗度洗涤刚涤刚切割的外植体切割的外植体伤伤口表面，或口表面，或过滤过滤灭灭菌后加入固体培养基的表菌后加入固体培养基的表层层其它抗氧化其它抗氧化剂剂有二硫有二硫苏苏糖醇、谷胱甘糖醇、谷胱甘肽肽、硫乙醇、抗坏血酸及二乙基二硫、硫乙醇、抗坏血酸及二乙基二硫氨基甲酸氨基甲酸酯酯等编辑课件8、活性炭：、活性炭：活性炭活性炭为为木炭粉碎木炭粉碎经经加工形成的粉沫加工形成的粉沫结结构，构，它它结结构疏松，孔隙大，吸水力构疏松，孔隙大，吸水力强强，有很，有很强强的吸附作用，的吸附作用，它的它的颗颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大它可以吸附培养基中的有害物越大它可以吸附培养基中的有害物质质，包括，包括琼琼脂中脂中所含的所含的杂质杂质，培养物在培养，培养物在培养过过程中分泌的酚、程中分泌的酚、醌类醌类物物质质以及蔗糖在高以及蔗糖在高压压消毒消毒时产时产生的生的5－－羟羟甲基糖甲基糖醛醛编辑课件v茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产产生生的致死性褐化物，其效力的致死性褐化物，其效力优优于于VC和半胱氨酸。

和半胱氨酸v在新梢增殖在新梢增殖阶阶段，活性炭可明段，活性炭可明显显促促进进新梢的形成和伸新梢的形成和伸长长v活性炭在生根活性炭在生根时时有明有明显显的促的促进进作用，其机理一般作用，其机理一般认为认为与与活性炭减弱光照有关活性炭减弱光照有关 编辑课件v在使用活性炭在使用活性炭时时，要注意其吸附有害物，要注意其吸附有害物质质和吸附生和吸附生长长调节调节物的二重性，尤其是当物的二重性，尤其是当较较高的活性炭足以能抵消高的活性炭足以能抵消生生长调节长调节物的作用物的作用时时，，应应注意注意调调整好活性炭与生整好活性炭与生长调长调节节物等培养基成分的用量，使其皆能物等培养基成分的用量，使其皆能发挥发挥作用在使作用在使用用时时要有其量的意要有其量的意识识，使活性炭，使活性炭发挥发挥其其积积极作用 编辑课件二、母液的配制和保存二、母液的配制和保存1、所、所谓谓母液是欲配制液的母液是欲配制液的浓缩浓缩液，液，这这可保可保证证各物各物质质成分成分的准确性及配制的准确性及配制时时的快速移取，并便于低温保藏的快速移取，并便于低温保藏 一般配成比所需一般配成比所需浓浓度高度高10～～100倍的母液。

倍的母液 母液配制母液配制时时可分可分别别配成大量元素、微量元素、配成大量元素、微量元素、铁盐铁盐、、有机物和激素有机物和激素类类等 编辑课件v配制培养基配制培养基时时，，为为便于保存，提高效率，通常先配制便于保存，提高效率，通常先配制母液即配成：母液即配成：v大量元素大量元素10倍液，定容至倍液，定容至1000ml；；v微量元素微量元素100倍液，定容至倍液，定容至1000ml；；v铁盐铁盐100倍液，定容至倍液，定容至1000ml；；v维维生素生素1mg/l，定容至，定容至100ml；；v激素激素1mg/l，定容至，定容至50～～100ml编辑课件2、配制、配制时时注意一些离子之注意一些离子之间间易易发发生沉淀，如Ｃ生沉淀，如Ｃa 2＋＋和和SO4 2 －－ ，，ＣＣa 2＋＋ 、Ｍ、Ｍg 2＋＋和和PO4 3－－一起溶解后，会一起溶解后，会产产生沉淀，一定要充生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中配制母液分溶解再放入母液中配制母液时时要用蒸要用蒸馏馏水或重蒸水或重蒸馏馏水药药品品应选应选取等取等级较级较高的化学高的化学纯纯或分析或分析纯纯药药品的称量及定容品的称量及定容都要准确。

各种都要准确各种药药品先以少量水品先以少量水让让其充分溶解，然后依次混其充分溶解，然后依次混合编辑课件3、一般配成大量元素、微量元素、、一般配成大量元素、微量元素、铁盐铁盐、、维维生素等生素等母液，其中母液，其中维维生素、氨基酸生素、氨基酸类类可以分可以分别别配制，也可配制，也可以混在一起母液配好后放入冰箱内低温保存，用以混在一起母液配好后放入冰箱内低温保存，用时时再按比例稀再按比例稀释释编辑课件1、、MS培养基母液的制培养基母液的制备备 2、、 MS培养基的配制培养基的配制 上述内容上述内容见实验见实验指指导导：：实验实验二、二、实验实验三三编辑课件三、三、 MS培养基的分装与培养基的分装与灭灭菌菌 1、培养基分装到、培养基分装到100ml的培养瓶中，用量一般的培养瓶中，用量一般为为每瓶每瓶30～～40ml，，过过多造成浪多造成浪费费，，过过少少则则不利于植物的生不利于植物的生长长2、培养基的、培养基的灭灭菌：菌：（（1））灭灭菌是指用物理或化学的方法，菌是指用物理或化学的方法，杀杀死物体表面和孔隙内死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质质全部全部杀杀死。

死 消毒是指消毒是指杀杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发发生危害作用，生危害作用，显显然然经过经过消毒，消毒，许许多多细细菌芽菌芽孢孢、霉菌的厚垣、霉菌的厚垣孢孢子等不会完全子等不会完全杀杀死，即消毒后的死，即消毒后的环环境里、物品上境里、物品上还还有活着的有活着的微生物 编辑课件v这这里所指的菌，包括里所指的菌，包括细细菌、真菌、放菌、真菌、放线线菌、藻菌、藻类类及其及其它微生物它微生物菌的特点是：极小，肉眼看不菌的特点是：极小，肉眼看不见见无无处处不不在，无在，无时时不有，无孔不入不有，无孔不入在自然条件下忍耐力在自然条件下忍耐力强强，，生活条件要求生活条件要求简单简单，繁殖力极，繁殖力极强强，条件适宜，条件适宜时时便可大便可大量滋生编辑课件v无菌的范畴是：无菌的范畴是：v经经高温灼高温灼烧烧或一定或一定时间时间蒸煮蒸煮过过后的物体后的物体v经经其它物理的或化学的其它物理的或化学的灭灭菌方法菌方法处处理后的物体理后的物体(当然当然这这些方些方法必法必须须已已经证经证明是有效的明是有效的)v高高层层大气、岩石内部大气、岩石内部。

v健康的健康的动动、植物的不与外部接触的、植物的不与外部接触的组织组织内部v强强酸酸强强碱，化学元素碱，化学元素灭灭菌菌剂剂等表面和内部等等都是无菌的等表面和内部等等都是无菌的从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多编辑课件2、常用的、常用的灭灭菌方法可分菌方法可分为为物理的和化学的两物理的和化学的两类类：： 物理方法如干物理方法如干热热(烘烘烧烧和灼和灼烧烧)、湿、湿热热(常常压压或高或高压压蒸煮蒸煮)、、射射线处线处理理(超声波、微波超声波、微波)、、过滤过滤、清洗和大量无菌水冲洗等、清洗和大量无菌水冲洗等措施 化学方法是使用升汞、甲化学方法是使用升汞、甲醛醛、、过过氧化氧化氢氢、高、高锰锰酸酸钾钾、来、来苏苏儿、漂白粉、次儿、漂白粉、次氯氯酸酸钠钠、抗菌素、酒精化学、抗菌素、酒精化学药药品品处处理 这这些方法和些方法和药剂药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当要根据工作中的不同材料不同目的适当选选用 编辑课件1、培养基用湿、培养基用湿热灭热灭菌：培养基在制菌：培养基在制备备后的后的24h内完成内完成灭灭菌菌工序。

工序 常用方法是：关常用方法是：关闭闭放气放气阀阀，通，通电电后，待后，待压压力上升力上升到到0.05MPa时时，打开放气，打开放气阀阀，放出空气，待，放出空气，待压压力表指力表指针针归归零后，再关零后，再关闭闭放气放气阀阀关阀阀再通再通电电后，后，压压力表上升达力表上升达到到0.1MPa时时，开始，开始计时计时，，维维持持压压力力0.1～～0.15MPa 20分分钟钟 编辑课件v对对高高压灭压灭菌后不菌后不变质变质的物品，如无菌水、栽培介的物品，如无菌水、栽培介质质、、接种用具，可以延接种用具，可以延长灭长灭菌菌时间时间或提高或提高压压力而培养基力而培养基要要严严格遵守保格遵守保压时间压时间，既要保，既要保压彻压彻底，又要防止培养底，又要防止培养基中的成分基中的成分变质变质或效力降低，不能随意延或效力降低，不能随意延长时间长时间编辑课件v对对于一些布制品，如于一些布制品，如实验实验服、口罩等也可用高服、口罩等也可用高压灭压灭菌洗洗净净晾干后用耐高晾干后用耐高压压塑料袋装好，高塑料袋装好，高压灭压灭菌菌20～～30minv高高压灭压灭菌前后的培养基，其菌前后的培养基，其pH值值下降下降0.2～～0.3 单单位。

位v高高压灭压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单为单糖，从而改糖，从而改变变培养基的渗透培养基的渗透压压 在在8％～％～20％蔗糖范％蔗糖范围围内，高内，高压灭压灭菌后的培养基菌后的培养基约约升高升高0.43倍 编辑课件v培养基中的培养基中的铁铁在高在高压灭压灭菌菌时时会催化蔗糖水解，可使会催化蔗糖水解，可使15％～％～25％的蔗糖水解％的蔗糖水解为为葡萄糖和果糖培养基葡萄糖和果糖培养基pH值值小于小于5.5，其水解量更多，培养基中添加，其水解量更多，培养基中添加0.1％活性％活性碳碳时时，高，高压压下蔗糖水解大大增下蔗糖水解大大增强强，添加，添加1％活性碳，％活性碳，蔗糖水解率可达蔗糖水解率可达5％编辑课件为为防止高防止高压灭压灭菌菌产产生的上述一些生的上述一些变变化可用下列方法：化可用下列方法：(1) 经经常注意搜集有关高常注意搜集有关高压灭压灭菌影响培养基成分的菌影响培养基成分的资资料，以便料，以便及及时时采取有效措施采取有效措施2) 设计设计培养基配方培养基配方时时尽量采用效果尽量采用效果类类似的似的稳稳定定试剂试剂并准确掌并准确掌握握剂剂量如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以量。

如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代代替替IAA，控制活性炭的用量，控制活性炭的用量(在在0.1％以下％以下)注意注意pH值对值对高高压压灭灭菌下培养基中成分的影响等菌下培养基中成分的影响等编辑课件(3) 配制培养基配制培养基时应时应注意成分的适当分注意成分的适当分组组与加入的与加入的顺顺序如将磷、如将磷、钙钙和和铁铁放在最后加入放在最后加入4) 注意高注意高压灭压灭菌后培养基菌后培养基pH的的变变化及回复化及回复动态动态如高压压灭灭菌后的菌后的pH值值常由常由5.80升高至升高至6.48而96h后又回降至后又回降至5.8左右这样这样在在实验实验中就可以根据中就可以根据这这一一规规律加以掌握律加以掌握编辑课件2、用于无菌操作的器械采用灼、用于无菌操作的器械采用灼烧灭烧灭菌菌3、玻璃器皿及耐、玻璃器皿及耐热热用具采用干用具采用干热灭热灭菌菌4、不耐、不耐热热的物的物质质采用采用过滤灭过滤灭菌菌5、空、空间间采用紫外采用紫外线线和熏蒸和熏蒸灭灭菌菌编辑课件实验实验二二 培养基（培养基（MS）母液的配制）母液的配制【目的】【目的】 (5分分) 了解培养基母液的配制方法和注意事了解培养基母液的配制方法和注意事项项；掌握培养；掌握培养基的配制及基的配制及灭灭菌方法，菌方法，为为植物愈植物愈伤组织诱导伤组织诱导准准备备培养培养基。

基原理】【原理】 (15分分) 对对植物外植体植物外植体进进行离体培养行离体培养时时，培养基提供生，培养基提供生长长所需的所需的营营养成分等培养基的主要成分包括无机养成分等培养基的主要成分包括无机营营养养物、碳源、物、碳源、维维生素、植物生生素、植物生长长物物质质和有机附加物等和有机附加物等编辑课件 配制培养基通常都按配方配制培养基通常都按配方浓浓度的若干倍称量，度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时时按比例按比例稀稀释释一般要配下列母液：大量元素母液、微量元一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、素母液、铁盐铁盐母液、植物生母液、植物生长长物物质质母液、有机化合母液、有机化合物母液编辑课件【【实验实验用品】用品】 (10分分)1．器具：．器具：电电子天平、冰箱、子天平、冰箱、pH试纸试纸、、烧烧杯、量筒、杯、量筒、试剂试剂瓶、瓶、三角瓶、洗耳球、刻度吸管、洗瓶三角瓶、洗耳球、刻度吸管、洗瓶2．．试剂试剂：硝酸：硝酸钾钾、硝酸、硝酸铵铵、硫酸、硫酸镁镁、磷酸二、磷酸二氢钾氢钾、、氯氯化化钠钠、、硫酸硫酸锰锰、硫酸、硫酸锌锌、硼酸、碘化、硼酸、碘化钾钾、、钼钼酸酸钠钠、硫酸、硫酸铜铜、、氯氯化化钴钴、、乙二胺四乙酸二乙二胺四乙酸二钠钠、硫酸、硫酸亚铁亚铁、甘氮酸、、甘氮酸、盐盐酸硫胺素、酸硫胺素、盐盐酸酸吡哆素、肌醇、吡哆素、肌醇、2,4-D、、6-BA、、 1 mol／／L盐盐酸、酸、1 mol／／L氢氢氧化氧化钠钠。

编辑课件【【实验实验方法】方法】 (30分，含操作分，含操作过过程程)1．．MS培养基母液配制培养基母液配制1）、大量元素母液配制）、大量元素母液配制(1) 按培养基配方按培养基配方(表表2-1)所列大量元素成分所列大量元素成分(NH4N03、、KN03、、KH2PO4、、MgSO4·7H2O和和CaCl2·2H2O)，取，取相相应应的分析的分析纯纯化学化学试剂试剂2) 将将1 L培养基所需各种大量元素培养基所需各种大量元素扩扩大大10倍，分倍，分别别用用100 mL烧烧杯，在杯，在电电子天平上子天平上进进行行实际实际称量编辑课件(3) 在盛有在盛有1种元素的种元素的烧烧杯中，加入杯中，加入约约10mL蒸蒸馏馏水，放置水，放置在磁力在磁力搅搅拌器上充分溶解后拌器上充分溶解后转转至另一至另一烧烧杯中按同杯中按同样样步步骤骤分分别别溶解各种大量元素后，与第溶解各种大量元素后，与第1种大量元素溶液混种大量元素溶液混合4) 混合液倒人混合液倒人1000 mL容量瓶中定容后，容量瓶中定容后，转转入入试剂试剂瓶中，瓶中，贴贴上上标签标签(注明配制注明配制时间时间、、扩扩大培数、配制人大培数、配制人员员姓名姓名)，，母液母液贮贮存于存于2～～4℃的冰箱中。

的冰箱中 微量元素母液、微量元素母液、铁盐铁盐母液、植物生母液、植物生长长物物质质母液、有母液、有机化合物母液的配制由老机化合物母液的配制由老师负责师负责编辑课件【思考【思考题题】】1、目前，常用的培养基有哪些？各有什么特点？、目前，常用的培养基有哪些？各有什么特点？(10分分)2、培养基包括哪些成分？各有什么作用和适宜、培养基包括哪些成分？各有什么作用和适宜浓浓度范度范围围？？(10分分)3、配制培养基母液、配制培养基母液时应时应注意什么注意什么问题问题？？(10分分)4、怎、怎样进样进行培养基的湿行培养基的湿热灭热灭菌？菌？(10分分)编辑课件实验实验三三 培养基（培养基（MS）配制与）配制与灭灭菌菌【目的】（【目的】（2分）分）学学习习培养基配制与培养基配制与灭灭菌方法菌方法【原理】【原理】 （（15分）分） 凡是暴露在凡是暴露在(未未经处经处理的理的)空气中的物体，曾空气中的物体，曾经经接触接触过过自然自然水源的物体都是有菌的培养基中含有大量的有机物，特水源的物体都是有菌的培养基中含有大量的有机物，特别别是含糖量是含糖量较较高，是微生物滋生、繁殖的极好高，是微生物滋生、繁殖的极好场场所。

而接种材所而接种材料需要在无菌得件下培养很料需要在无菌得件下培养很长长的的时间时间，如果培养基被微生物，如果培养基被微生物所所污污染，便达不到培养的染，便达不到培养的预预期期结结果编辑课件 因此，培养基的因此，培养基的灭灭菌，是植物菌，是植物组织组织培养中十分重要的培养中十分重要的环节环节培养基灭灭菌的方法有多种，本菌的方法有多种，本实验实验田采用高田采用高压压蒸蒸气气灭灭菌法（即湿菌法（即湿热灭热灭菌原理是：在密菌原理是：在密闭闭的蒸的蒸锅锅内，其内，其中的蒸汽不能外溢，中的蒸汽不能外溢，压压力不断上升，使水的沸点不断提力不断上升，使水的沸点不断提高，从而高，从而锅锅内温度也随之增加在内温度也随之增加在0.10MPa的的压压力下，力下，锅锅内温度达内温度达121℃在此蒸汽温度下，可以很快在此蒸汽温度下，可以很快杀杀死各种死各种细细菌及其高度耐菌及其高度耐热热的芽的芽孢孢编辑课件【【实验实验用品】用品】 （（3分）分）1．器具：台秤、．器具：台秤、烧烧杯、量筒、三角瓶、移液管、玻璃漏杯、量筒、三角瓶、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒、玻璃斗、玻璃棒、玻璃铅铅笔、笔、pH值试纸值试纸、洗耳球、、洗耳球、线绳线绳、、包包头纸头纸、石棉网、洗瓶。

石棉网、洗瓶2．．试剂试剂：蔗糖、：蔗糖、琼琼脂、脂、1N NaOH、、1N HCl、各种培养基、各种培养基母液编辑课件【【实验实验方法】方法】 （（50分，含操作）分，含操作）1．培养基配制．培养基配制本本实验实验以以6人人为为一大一大组组，按，按500ml容量一容量一组组配制培养基配制培养基 1) 首先洗首先洗净净盛装培养基的容器，烘干或自然晾干；盛装培养基的容器，烘干或自然晾干； (2) 按照下面公式，按照下面公式，计计算需配制培养基的量，然后根据算需配制培养基的量，然后根据各种母液各种母液扩扩大的倍数，大的倍数，计计算从母液中吸取的毫升量算从母液中吸取的毫升量吸取量吸取量(mL)=[需要配制培养基的体需要配制培养基的体积积(mL)×需要配制需要配制浓浓度度(mg／／L)]／母液／母液浓浓度度(mg／／L)编辑课件(3) 用用1个个100 mL烧烧杯，分杯，分别别从各种母液吸取用量，加入蔗糖从各种母液吸取用量，加入蔗糖15g (4) 称取称取琼琼脂脂5 g，置于，置于1个个1000 mL烧烧杯中，加蒸杯中，加蒸馏馏水水100 mL，在，在电电炉上加炉上加热热溶解5) 将将100 mL的的琼琼脂溶化液和脂溶化液和100 mL培养基成分充分混合，培养基成分充分混合，定容至定容至500 mL，，1N NaOH或或1N HCl将将pH值调值调至至5.8，以，以40 mL／瓶分装至培养瓶中。

／瓶分装至培养瓶中6) 封好瓶，在封好瓶，在标签标签上写明培养基代号上写明培养基代号 编辑课件2．培养基的．培养基的灭灭菌菌 高高压压蒸汽蒸汽灭灭菌法：把分装好的培养基及所需菌法：把分装好的培养基及所需灭灭菌的各菌的各种用具、蒸种用具、蒸馏馏水等，放入高水等，放入高压灭压灭菌菌锅锅的消毒桶内，加水的消毒桶内，加水至高水位盖好至高水位盖好锅锅盖，上好螺盖，上好螺丝丝，关，关闭闭放气放气阀阀通电电后，后，待待压压力上升到力上升到0.05MPa时时，打开放气，打开放气阀阀，放出空气，待，放出空气，待压压力表指力表指针归针归零后，再关零后，再关闭闭放气放气阀阀关阀阀再通再通电电后，后，压压力力表上升达到表上升达到0.1MPa时时，在，在122~124℃下保持下保持15~20 min，，即可达到消毒目的即可达到消毒目的编辑课件高高压压蒸气蒸气灭灭菌注意事菌注意事项项：：（（1））锅锅内冷空气必内冷空气必须须排尽，否排尽，否则压则压力表指力表指针虽针虽然达到一定然达到一定压压力，但由于力，但由于锅锅内冷空气的存在并达不到内冷空气的存在并达不到应应有的温度，因而影有的温度，因而影响响灭灭菌效果。

在菌效果在实际实际操作操作过过程中常程中常压压力上升到力上升到0.05MPa时时排排2次次气气（（2）当达到一定）当达到一定压压力后，注意在保持力后，注意在保持压压力力过过程中，程中，严严格遵守格遵守时间时间，，时间过长时间过长会使一些化学物会使一些化学物质质遭到破坏，影响培养基成遭到破坏，影响培养基成分，分，时间时间短短则则达不到达不到灭灭菌效果3）培养瓶中的液体不超）培养瓶中的液体不超过总过总体体积积的的70%，否，否则则当温度超当温度超过过100℃℃时时，培养基会，培养基会喷喷溢，造成培养基瓶壁和包溢，造成培养基瓶壁和包头纸头纸的的污污染编辑课件 制制备备好的培养基好的培养基应应保存在保存在2~25℃避光的避光的环环境，境，有条件置冰箱有条件置冰箱4~8℃冷藏冷藏储储存存较较好培养基若保存于好培养基若保存于非密非密闭闭容器中，容器中，应应在三周内使用；若保存于密在三周内使用；若保存于密闭闭容容器中，可在一年内使用器中，可在一年内使用编辑课件【思考【思考题题】】 （（30分）分）1、、灭灭菌和消毒有无差菌和消毒有无差别别？？为为什么？什么？2、常用的、常用的灭灭菌方法各有哪些菌方法各有哪些优优缺点？缺点？3、采用高、采用高压压蒸汽蒸汽锅锅高高压灭压灭菌菌时时，，应应注意哪些事注意哪些事项项？？编辑课件。