碧波Caspase-9活性分光光度法检测试剂盒.doc

For Research Use Only碧波 Caspase-9 活性分光光度法检测试剂盒Cat Number：Specification：Store at:4℃ for one year Expire date：MADE BY BIOBOX碧波 Caspase-9 活性分光光度法检测试剂盒一、产品简介Caspase 9 活性分光光度法检测试剂盒(Caspase 9 Activity Colorimetric Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中 Caspase 9 酶活性或纯化的 Caspase 9 酶活性的试剂盒。

Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族Caspase 9也称 ICE-LAP6 或 Mch6，有时被写作 caspase-9 或 caspase9，是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase线粒体释放细胞色素 c 以后，caspase 9 可以和细胞色素 c 以及 Apaf1 形成复合物，同时被激活激活的caspase 9 可以激活细胞凋亡的最关键酶 caspase 3，从而促进后续的细胞凋亡信号Caspase 9 的激活可以通过磷酸化进行调控Caspase 9 也称 FLICE、MACH 或 Mch5，有时被写作 Caspase-9 或 caspase8，通常以酶原的形式存在，在细胞凋亡的信号转导过程中被激活Caspase 9 被认为是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase Caspase-9 在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，它被激活Caspase-9 活性分光光度法检测试剂盒就是将 Caspase-9 序列特异性的多肽 Ac-LEHD-pNA (acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)偶联至发色基团：pNA (p-nitroaniline)；当该底物被 Caspase-9 剪切后，黄色基团 pNA 即游离出来，可通过酶标仪或分光光度计（λ=405nm 或 400nm）测定其吸光值，考察 Caspase-9 的活化程度。

pNA在 405nm 附近有强吸收本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织 Caspase-9 活性的检测二、试剂盒组份组份 Cat:BB322020 assaysCat:BB325050 assaysCat:BB32100100 assays 储存条件裂解液 5.0 mL 10.0 mL 15.0 mL -200C2×反应液 1.0 mL 2. 5 mL 5.0 mL -200CAc-LEHD-pNA 100μL 250μL 500μL -200C，避光DTT 50 μL 100 μL 150 μL -200C三、试剂盒以外自备仪器和试剂低温高速离心机、酶标仪或分光光度计（100μL的比色皿） 、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）1.5m L离心管、PBS、蛋白定量试剂及仪器四、保存条件：-20℃保存，Ac-LEHD-pNA需避光保存五、注意事项： 1、须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100µl的分光光度检测杯及相应分光光度计。

优先考虑测定A405，如有困难可以测定A400 2、Ac-LEHD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装和避光保存3、测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒4、有文献报道少数类型的细胞凋亡检测不到Caspase 9的激活可能存在非依赖于Caspase-9 活化的机制，这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-9 活性无明显改变，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路5、本试剂盒的裂解液可以和碧波生产的其它Caspase活性检测试剂盒的裂解液通用，即本试剂盒裂解液制备的蛋白样品可以用于碧波其它Caspase活性检测试剂盒的检测6、细胞数量需达到3～5×10 6个或新鲜组织100mg，以便能达到测定需要的100～200μg蛋白的要求，因为Caspase-9 的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关，如测定的OD值偏低，可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量7、样品中激活的caspase水平很低首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase的激活。

可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、6和8小时等具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作六、操作规程1、 准备工作：a.、裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用b、裂解液工作液的准备：使用前每50μL 裂解液加入0.5μL DTTc、2 ×反应液溶解后混匀并置于冰浴上备用2、 样品的处理a、对于悬浮细胞把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，离心（2000rpm，5min）收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30min，其间涡旋振荡3～4次，每次10 s ；或冻融2～3次下转第3步进行实验b、对于贴壁细胞按常规的方法用胰酶消化贴壁细胞，并收集细胞用PBS洗涤一次，吸尽上清后，按照每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30min，其间涡旋振荡3～4次，每次10 s ；或冻融2～3次下转第3步进行实验c、对于组织样品每50mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm 左右的小块，加入50μL 冰冷裂解液工作液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。

然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟下转第3步进行实验3、 4℃ 离心（12，000rpm， 10～15min）4、 小心吸取上清（含裂解的蛋白质）转移至新的管中，并放置冰上待用5、 立即测定Caspase 9的酶活性或-70℃保存样品，同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度如果细胞较小，可以适当增加细胞的用量6、 Caspase 9酶活性的检测：a、 取出适量的Ac-LEHD-pNA 和2×反应液，置于冰浴上备用b、 使用前每50μL 2× 反应液加入 0.5μ L DTTc、 吸取50μL含100~200 μg蛋白的细胞或组织裂解上清；如体积不足50μL用裂解液补足至总体积50μL（各组均采用同样的蛋白量进行测定和比较） d、 如下设置反应体系：空白对照 样品2×反应液 50μL 50μL裂解液 50μL 0μL待测样品 0μL 50μLAc-LEHD-pNA 5μL 5μL总体积 105μL 105μLe、 加入Ac-LEHD-pNA后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。

37℃ 孵育4hr发现颜色变化比较明显时即可测定A 405如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜f、 用酶标仪或分光光度计（100μL的比色皿）在λ=405nm或400nm测定其吸光值g、 通过计算OD 诱导剂 /OD阴性对照 的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-9 活化程度7、 参考Chemicon公司的Caspase 9酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-LEHD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃可以剪切1nmol Ac-LEHD-pNA 产生1nmol pNA的Caspase 9的酶量这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的Caspase 9说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在 37℃孵育4个小时以内底物都是饱和的；对于样品中Caspase 9酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。