过氧化氢酶活力的测定实验报告doc.docx

过氧化氢酶活力的测定实验报告篇一：过氧化氢酶活性测定实验29过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植 物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定一、 原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含 有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起 传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂可根 据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小在反应 系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反 应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过 氧化氢即可求出消耗的H2O2的量二、 材料、仪器设备及试剂（一） 材料：小麦叶片（二） 仪器设备：1.研钵；2.三角瓶；3.酸式滴定 管；4.恒温水浴；5.容量瓶三） 试剂：1. 10%H2SO4； 2. 0.2 mol/L pH7.8 磷酸 缓冲液；3. 0.1mol/L高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR） 3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于 17.6mol/L，取 30%H2O2 溶液 5.68ml，稀释至 1000ml，用标 准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g,用蒸馏 水溶解后，定容至1000ml。

三、 实验步骤（一） 酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸 缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该 缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液 定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提 液二） 取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照）， 测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/LH2O2,同时计时，于30°C恒温水浴中保温10min， 立即加入 10%H2SO42.5ml用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在 30min内不消失）为终点四、 结果计算酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min） = （A — B）XVT/（W XVSX1.7Xt）式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定 ml数；VT提取酶液总量（ml）；VS反应时所用酶液量（ml）； W样品鲜重（g）； t反应时 间（min）；1.71ml0.1mol/L KMnO4 相当于 1・7mgH2O2过氧化氢酶的活性测定在植物体中，黄素氧化酶类的代谢产物常包含H2O2, 如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。

H2O2的积累可导致破坏性的氧化作用，而过氧化物酶和过氧化氢酶则可以清除H2O2,是植物 体内重要的活性氧清除系统之一其活性还与植物的抗逆性有密切关系，本实验利用高锰酸钾 滴定法测定过氧化氢酶活性一、原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能 催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，H2O2则既是氧化剂，又 是还原剂R(Fe+2) +H2O2=====R(Fe+3OH-)2R(Fe+3OH-)2+H2O2===R(Fe+2)2 + 2H2O+O2合并上式：2H2O2====2H2O + O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活 力大小在反应系统中加入一定量(反应过量) 的过氧化氢溶 液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢5H2O2 + 2KMnO4 + 4H2SO4 — 5O2 + 2KHSO4 + 8H2O +2MnSO4即可求出消耗的H2O2量二、 仪器和用具：研钵、三角瓶50cm3X4、铁架、酸式 滴定管、恒温水浴、容量瓶三、 试剂：10%H2SO4； 0.2mol/l 磷酸缓冲液 pH7.8；0.1mol/l高锰酸钾标准液：3.1605gKMnO4 （AR）用新 煮沸的蒸馏水配制成1000ml,用0.1mol/l的草酸溶液标定；0.1mol/l H2O2： 市售 30%H2O2 大约等 于17.6mol/l,取30%H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml,用标准0.1mol/l KMnO4溶液（在酸性条件下） 进行标定。

四、 方法：1. 酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm离心，上清液即为过氧化氢酶粗提液2. 取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测 定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液2.5ml； 再加入 2.5ml 0.1mol/l H2O2,同时计时间， 于30°C恒温水浴中保温10分钟，立即加入 10%H2SO4 2.5ml3. 用0.1mol/l KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红 色（在30分钟内不消失）为终点4. 结果计算：酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H2O2的毫克数 表示：（A-B）*Vt/V1*1.7酶活（酶分解的H2O2 mg/g鲜重）=W式中： A 对照用KMnO4 ml数 B 酶反应后KMnO4滴定ml数V t 酶液总量ml V1 反应所用酶液量mlW样品鲜重（g）1.7——1ml 0.1mol/l KMnO4 相当于 1.7mg H2O2［注意］・所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要经过标 定，0.1mol/l H2O2要新配制。

实验48过氧化物酶活性的测定（比色法）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶， 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变 化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化一、 原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm的吸光度变化测定过氧化 物酶活性二、 实验材料、试剂与仪器设备（一） 实验材料马铃薯块茎二） 试剂1 . 100 mmol / L磷酸缓冲液pH6.0 （见附录）2 .反应混合液：100 mmol / L磷酸缓冲液（pH6.0 ）50 mL于烧杯中，加入愈创木酚28 ^1，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 %过氧化氢19 ^1，混合均匀，保存于冰箱中三） 仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL容量瓶，吸 管，离心机三、 实验步骤1 .称取植物材料1 g，剪碎，放入研钵中，加适量 的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000 r / min离心15min，上清液转入100 mL容量瓶中，残渣再用5 mL磷 酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。

2 .取光径1 cm比色杯2只，于1只中加入反应混 合液3 mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL （如酶活性 过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470 nm下吸光度值，每隔1min读数 一次四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以AA 470 /［min • g （鲜重）］表示之也可以用每min内A 470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u ） 表示过氧化物酶活性［u/ （ g • min ）］=式中：△ A 470 ——反应时间内吸光度的变化W 一 一植物鲜重，gV T——提取酶液总体积，mLV s ——测定时取用酶液体积，mL反应时间，min o蒲圻贝母 Fritillaria puqiensis G.D.Yu et G.Y.Chen 是贝母属中一新种，其有效成分生物碱含量较高，止咳效果 显著［1, 2］其中的蒲贝酮碱的效果与可待因相似，且无 成瘾性，已被国家新药办立项进行一类新药开发但由于蒲 圻贝母以野生为主，连年的采挖已使其资源逐渐枯竭，难以 为新药开发提供资源保证，为此我们对其进行了组织培养。

蒲圻贝母鳞茎切块培养22d左右，可直接从切片边缘长出多 个小鳞茎，以后小鳞茎逐渐长大为了探讨鳞茎发生的机理， 并为研究提高组培贝母鳞茎的生长率，诱发多鳞茎形成的方 法，我们在培养的不同时期取材，对鳞茎形成过程中的可溶 性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶的酶谱变化进行了分析1材料和方法1.1材料蒲圻贝母F.puqiensis取自湖北省蒲圻市，经中国药科 大学生药教研室李萍博士鉴定新鲜的蒲圻贝母鳞茎在流水下冲洗3h，0.1%氯化汞表面 消毒20min，无菌水冲洗5次，切成0・5cmX0・5cmX0・2cm 的小块接种于MS附加BA 2mg/L-1，IAA 1mg/L-1的培养基 上，在25 r黑暗条件下培养，获得无菌材料分别在培养的 不同时间取材，并以未进行培养的新鲜贝母鳞茎为对照，进 行可溶性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱分析1.2方法1.2.1试剂的配制与凝胶的制备：参考文献［3］的方 法分离胶浓度为7.5%，间隔胶浓度为2.5%1.2.2样品制备：称取新鲜的贝母鳞茎1g，在低温冰箱 内放置1h后，加少许石英砂，^口 3ml提取缓冲液(0.1mol/L pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液，其中含 0.5mol/L 蔗糖，0.06mol/L 抗坏血酸，0・006mol/L半胱氨酸)，在低温下研磨后离心 20min，5000r/min，取上清液置-20°C下保存。

1.2.3电泳：采用垂直板式聚丙烯酰胺凝胶电泳，加入 漠酚蓝作为指示染料稳定电流强度为12〜24mA可溶性蛋 白的点样量为50^l，用含0.05%考马斯亮蓝的12.5%三氯乙 酸溶液染色4h过氧化物同工酶的点样量为30^l，用抗坏 血酸-联苯胺染液染色，其组成为抗坏血酸70.4mg，联苯胺 储存液20ml(2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再 加水72ml)，0.6%过氧化氢20ml，水60ml酯酶同工酶的点 样量为50^l，按薛应龙】4］方法，即凝胶在0・2mol/L， Tris-HCl缓冲液(pH 7.1)预浸10min，然后移入含有7%醋酸 -a-萘酯的丙酮溶液 0.5ml，坚牢蓝12.5mg，0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.1)1ml，水23.4ml的染色液中染色 10〜30min，棕红色的同工酶谱带即呈现2结果与分析按谱带颜色的深浅程度将其划分为重带、次重带、轻带， 并按迁移率的大小划分为3个区，Rf在0.1〜0.3为慢速区（A）,在0.4〜0.6为中速区（B）,在0.7〜0.9为快速区（C） 篇二：过氧化氢酶活性的测定华南农业大学实验报告专业班次11农学一班 组另IJXX30010110题目 影响 酶促反应的因素姓名梁志雄日期【实验原理】1、酶的化学本质是蛋白质，作为催化剂，与一般的有机和 无机的催化剂相比较，有其相同之处，但也有其特异性。

酶 促反应的速度要比一般的催化剂催化的反应速度要快得多， 本实验比较生马铃薯糜（含活泼过氧化氢）、熟马铃薯糜（已 将过氧化氢钝化）、铁粉对于这个反应的催化效果，放出的 氧气气泡越多，反应速度越快2、酶的重要特性之一就是其催化的专一性。