水稻OsNRAMP5基因低镉积累突变位点功能标记的开发与验证.docx

水稻0SNRAMP5基因低镉积累瘦位^功能标iEfi勺开发与验证表1 〃/〃标记引物序列Table 1 Primer sequences of nra5fun引物名称引物序歹(55)碱基数 (bp)nra5Jun-afACAGGTGAGtAAGCTGGAGTF21nr(i5fun-arGGAGAtGACGGCGATGTTTATC22nni5fun-\)fCTCGGAtCTCTTGTCATGCC20nr(i5fun-brGTATGgATCgATGTA A A AGCGT AC A25引物序列中小写字母代表弓I人的错配碱基，有下划线的核甘酸表示 功能SNPnrafun-af S'GTGGAACTGCATGAAAATTGATTGATGAATTTTTTTTGAAAAAAAACAGGTGAGGAAGCTGGAGTT TCTGATATCGATGCTGGTGTTCGTGATGGCGGCGTGCTTCTTCGGGGAGCTGAGCATCGTGAAGCC GCCGGCGAAGGAGGTGATGAAGGGGCTCTTCATCCCCAGGCTCAACGGCGACGGCGCCACCGCCGAnrafiin-bf 5, -CTCGGAtCTCTTGTCATGCC-3, 9311 CGCCATTGCCCTCCTCGGAGCTCTTGTCATGCCGTACGCTTTTACATACATACATACATACGC/^C Icdl CGCCATTGCCCTCCTCGGAGCTCTTGTCATGCTGTACGCTTTTACATACATACATACATACGCAACI I I I I I I I I I I I I I 1*1 I 1*1 I I I I3' -ACATGCGAAAATGTAgGTAgGTATG-5, nrafun-br3' -CTATTTGTAGCGGCAGtAGAGG-51 nrafun-^x图1功能标记〃m仍〃引物设计策略I'ig. 1 Primer design strategj of functional marker nraSfun退火程度 55 X. 56 V. 57 七 58 T 59 V. 601：61 1：62 TM ♦- +/- + - +/- ♦ - W- + - +/- ♦ -♦- ♦/- ♦ ■ +/■ + -M：I)X \ marKrr(：h.ll ;-：931 !：♦/-： 5? 23ll/| Icmprraturrk水稻(Oryza sativa L.)是全球近半数人口的主要粮食作物，是中国仅次于玉米的主要粮食作物，广泛分布于中国 六大稻区。

随着工农业的高速开展和城市化进程的推进，土壤重金属污染已经成为世界范围内的一个重要环境问题，中 国面临的形势更加严峻⑴同时，由于工业“三废”的不合理排放、污水的大量灌溉、污泥的大量利用、农药及化肥的过 量使用等原因，使得土壤中的重金属镉(Cd)含量持续增加，Cd污染日益严重［2］研究发现，水稻比其他谷类作物更 容易积累Cd,且Cd可以通过根系在植株中运输和积累，尤其是在可食用的稻米局部，而Cd在稻米中的积累威胁到了 粮食平安［3-4］特别是近年来，中国南方出现的“镉大米”引起了人们对大米等农产品Cd污染的极大关注⑸此外，相 关研究发现，高浓度的土壤Cd污染会导致水稻减产⑹2005年的调查数据显示，中国受Cd污染的耕地面积近1.33x104 hm2,由此每年造成粮食减产在1x107t以上，受Cd污染的稻谷近2x1063直接经济损失超过2x1010元［7］为了避 免水稻中Cd积累过量，近年来科学家们提出并研究了一些降低水稻籽粒中Cd积累量的技术措施，主要包括使用物理、 化学和生物方法阻碍稻田Cd经根系进入植株体内、适当配施有机肥和化肥、采用间作或作物轮作、适当采用田间淹水 管理等农艺调控措施，以及利用分子生物学和遗传学方法培育低Cd积累水稻品种的育种调控措施等［8］。

其中，培育低 Cd积累水稻品种被认为是减少稻米Cd含量效果最好和最经济的方法［9］可以看出，低Cd积累水稻品种的选育，对人 体健康、食品平安、粮食稳产和环境保护等具有重大意义近年来，研究人员在探索植物吸收Cd的生理、生化及分子生物学的过程中，相继挖掘、研究了许多调控或参与调 控水稻Cd吸收、运输和积累的相关蛋白质目前，研究者至少已经克隆了 34个相关基因，其中一些关键基因的发现对 水稻低Cd积累育种具有重要的应用价值［5, 10］o OsHMA3是一个位于7号染色体上的控制水稻Cd积累的基因，是 P1B类型的重金属ATP酶（HMA）基因家族成员，该基因的表达主要在根部，相关研究发现，水稻中有9个HMA基 因，过表达OSHMA3会抑制Cd从水稻根系向植株的运输，因此过表达OSHMA3基因能显著降低稻米Cd含量，而不 影响其他微量元素含量［11-13］OsCdl是位于水稻3号染色体上的一个与谷粒Cd积累相关的基因，它属于膜转运蛋白 质的主要协同转运蛋白超家族（Major facilitator superfamily, MFS）基因，主要在根细胞的质膜中表达粳稻的主要 基因为OsCd1V449,釉稻的主要基因为OsCd1D44,在釉稻中导入粳稻OsCd1V449基因可显著降低谷粒Cd含量， 且对植株生殖生长和产量等性状无显著影响［14］。

水稻自然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural resistance-associated macrophage protein, NRAMP）基因是一种高度保守的二价金属离子转运蛋白质家族基因成员，目前在水稻基因组中 发现的NRAMP基因有7个，其中OSNRAMP5位于其根、外皮层的远端，因此在根内具有较高表达量，其编码的蛋白 质位于细胞质膜上，主要参与根系对镒（Mn）和Cd的吸收［15］研究发现，OSNRAMP5基因敲除或表达量的减少会 显著降低水稻对Cd、Mn的吸收量，优而导致其对Cd的积累量减少，但在低Mn环境下会影响植株的生长，同时也会 影响植株产量［16-20］而Chang等［21］研究发现，虽然过量表达OsNRAMP5基因促进了根系对Cd和Mn的吸收，但 是由于Cd在木质部径向运输的中断，使得Cd从根到茎的运输量减少，导致稻米中的Cd含量降低了 49%〜94%有 研究发现，通过水稻OSNRAMP5基因的突变亦可显著降低稻谷中Cd含量［22-23］Ishikawa等［22］利用碳离子束辐射 日本水稻品种越光获得了 3个低Cd突变体，研究发现，由于OSNRAMP5基因突变，导致Cd的积累量显著减少。

Ca 等［23］利用甲磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate, EMS）对釉稻品种9311进行诱变，获得低Cd积累突变体Icd1,进 一步鉴定发现，在不同Cd污染试验田，突变体Icd1稻谷Cd含量仅为0.02〜0.13mg/kg,而野生型9311稻谷Cd含 量达1.02〜4.44mg/kg,可能由于OsNRAMP5基因的1个碱基的突变，导致稻谷Cd积累量的大幅度降低本研究基 于突变材料Icd1中OSNRAMP5基因1个碱基的单核甘酸突变，参照四引物扩增受阻突变PCR （Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR, Tetra-primer ARMS-PCR）原理，设计出含 4 条引物、与 OsNRAMP5 基因突变位点共别离的共显性功能标记，进一步利用该标记对不同水稻种质资源和金23B八cd1的杂种F1代植株通过 PCR扩增进行验证，以期开发出功能标记为低Cd积累水稻材料的分子育种研究奠定基础1材料与方法1.1参试材料供试水稻材料：含有OSNRAMP5基因SNP突变的材料led 1 ［23］,由湖南省水稻研究所提供;18份来自不同地区 的粕稻品种（R1044、R43-02、R1269、华占、荃 9311B、野香 B、金 23B、农香 42、R106、R299、R900、广恢 390、 农香39、岳恢9113、珞红5B、望恢006、黄华占、湘早粕45）,包括常规釉稻、野生型保持系、红莲型保持系;18份 来自不同地区常规粳稻品种（长粒香、吉粳1、吉粳88、辽粳287、龙粳5号、宁粳4号、千重浪2号、中花11、东 稻2号、东稻3号、东稻4号、绥粳4号、越光、长白10号、长选10、东农416、龙粳21、长白9号）；金23BAcd1 （杂交F1代材料）、对照釉稻品种9311。

上述粕稻、粳稻、杂交F1代材料由笔者所在课题组保存或改造1.2OSNRAMP5基因SNP突变功能标记的设计与合成突变材料Icd1 7号染色体上0SNRAMP5基因的第7外显子的8 887 787位单核甘酸的隐性突变，会导致Icd1籽 粒Cd含量急剧降低研究发现，突变体Icd1中该位点的碱基为T,而野生型釉稻9311中该位点的核昔酸为C［23］因 此，笔者针对0SNRAMP5 （基因位点：BGIOSGA024510. 0s07g0257200）基因编码区8 887 787位点存在的单个 SNP,参照ARMS-PCR的分子标记原理，设计了由4引物（表1 ）组成的功能标记nra5fun,在引物nra5fun-af.nra5fun-ar. nra5fun・bf中各设计了 1个错配碱基，在引物nra5fun-br中分别设计了 2个错配碱基（表1中的小写字母）使用 工具Primer3web （ ： //primer3.ut.ee/） Primer BLAST进行引物设计、引物Tm值（指在模板DNA过量的情况下， 有50%的引物与模板精确配对，50%的引物处于解离状态时的温度）筛选及引物特异性评估等。

由北京擎科新业生物技 术完成nra5fun功能标记引物的合成和目的DNA片段的测序1.3DNA提取与分子标记检测水稻移栽14d后取供试材料的叶片，用十六烷基三甲基澳化筱（CTAB）法提取DNA用10 PlpCR扩增体系对 供试材料的目的片段进行扩增，体系组分：5 PI 2xRapid Taq Master Mix （由南京诺唯赞生物科技合成），13 10pmol/L表1中的4种引物等量混合物（经验证调整后，4种引物按1 : 1 : 1 : 2的比例进行混合PCR效果较好）， IpIDNA模板，3plddH2Oo在55.0〜62.0 ℃进行最适退火温度探索，最后确定最正确退火温度为61 °C用质量分数为 3.0%的琼脂糖凝胶电泳检测本试验的PCR扩增产物2结果与分析2.1 nra5fun功能标记的开发根据OSNRAMP5基因单个SNP的突变（C-T）,本研究开发了 4条引物的突变功能标记nra5fun （图1）首 先设计1对外引物nra5fun-af和nra5fun-ar作为对照，并各引入1个错配碱基，野生型和突变型水稻材料均可以扩增 出大小为723 bp的条带，且扩增产物都包含功能性SNP位点，然后根据SNP突变位点设计2条反向内引物nra5fun-br 和nra5fun-bf,其中引物nra5fun-br与突变型基因匹配，其3'端对应突变碱基T,引物nra5fun-bf与野生型基因匹配， 其3'端对应碱基C。

同时为了进一步增强PCR目的条带的特异性扩增，在引物nra5fun-br5'端第6、10位分别设计错 配碱基G,在引物nra5fun-ar5'端第6位设计错配碱基T参照4条引物设计策略进行预测：引物nra5fun-br/nra5fun-af 可扩增出大小为210 bp的条带，为突变型材料Icd1特有条带;引物nra5fun-bf/nra5fun-ar可扩增出大小为5。