二十二章节高效液相色谱法ppt课件.ppt

第二十二章 高 效 液 相 色 谱 法第一节 概述• 高效液相色谱法〔high performance liquid chromatography, HPLC〕是20世纪六十年代末在经典液相柱色谱法的根底上引入了气相色谱的实际和技术，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器开展而成的分别分析方法第一节 概述• 经典柱色谱法流动相是在常压或低压下运转，传质速度慢，所用固定相颗粒粗，柱效低，分别时间长；色谱柱不能延续运用；样品用量大，灵敏度低；除了用于制备分别外，不 能检测HPLC和GC的根本实际一致，定性定量原理完全一样，均可用计算机控制色谱条件和色谱的处置程序进展检测 第一节 概述•HPLC和GC的不同点为：•①流动相不同：GC用气体做流动相，载气种类少，性质接近，改动载气对柱效和分别效率影响小HPLC以液体做流动相，且液体种类多，性质差别大，可供选择范围广，是控制柱效和分别效率的重要要素之一；•②固定相差别：GC多是固体吸附剂或在担体外表上涂渍液体固定相，且粒度粗HPLC大都是新型的固体吸附剂、化学键合相等，粒度小〔普通为3～10μm〕；•③运用范围更广：GC主要用于挥发性、热稳定性好的物质的分析。

因此，GC只能分析占有机物总数15%～20%的物质HPLC可分析高沸点、难挥发和热不稳定的化合物、离子型化合物和高聚物乃至生物大分子等物质第一节 概述• HPLC采用高灵敏度检测器，如紫外检测器的最小检丈量可达纳克(10-9g)级、荧光检测器的灵敏度可达10-11gHPLC的特点：分别效率高、分析速度快、灵敏度高、色谱柱可反复运用、流动相可选择范围宽、流出组分容易搜集、操作自动化、适用范围广第二节 高效液相色谱仪• 高效液相色谱技术得到迅速开展，根本原理和色谱流程都是一样的，依然由流动相保送系统、进样系统、色谱分别系统、检测记录数据处置系统组成• 溶剂贮器1中的流动相经混合室2混匀，被泵3吸入，然后输出，导入进样器5被分析样品用注射器6由进样器处注入，并随流动相一同依次经过预柱7、色谱柱8后进入检测器9检测信号经过数据系统10处置，记录色谱峰面积和色谱图假设是制备色谱，可以运用馏分搜集器11复杂样品采用梯度洗脱〔借助于梯度控制器4〕使样品各组分均得到最正确分别整个仪器可由微处置机支配，包括数据处置和操作控制液相色谱仪〔液相色谱仪〔2〕〕第二节 高效液相色谱仪一、输液系统〔一〕流动相贮器流动相贮器俗称贮液瓶，它对大多数有机化合物呈化学惰性，耐酸碱腐蚀。

常见质地为玻璃或塑料，容量约为0.5L～2.0L，通常无色透明，假设流动相需避光，有棕色瓶供选择贮液瓶放置位置要高于泵体，以便坚持一定的输液静压差运用过程贮液瓶应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的改动和防止空气中的O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中第二节 高效液相色谱仪•〔二〕脱气安装• 流动相在运用前必需进展脱气处置，目的是除去其中溶解的气体在装入贮液瓶之前必需经过0.45μm滤膜过滤为了使溶剂便于脱气，贮液瓶常需贮备抽真空及吹入惰性气体安装在洗脱过程中如存在气泡会添加基线噪音，严重时使分析灵敏度降低此外溶解在流动相中的氧气，会呵斥荧光猝灭，影响荧光检测器的检测，还能够导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改动柱的分别性能常用的脱气方法有如下几种：第二节 高效液相色谱仪•1．超声波振动脱气 运用超声波提取器的方法，将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中，用超声波振荡10～30min此法较简单、常用•2．抽真空脱气 用微型真空泵，降压至0.05～0.07Mpa既可除去溶解的气体，运用水泵衔接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可以一同完成过滤机械杂质和脱气的双重担务由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂的体系脱气。

对于多元溶剂体系，每种溶剂应预先脱气后再进展混合，以保证混合后的比例不变第二节 高效液相色谱仪•3.加热回流脱气 用于需求彻底脱气的流动相〔电化学检测器〕，由于运用了回流冷凝器可减少挥发性组分的损失此法的脱气效果较好，不提倡用于混合流动相•4.吹氦脱气 运用在液体中比空气溶解度低的氦气在0.1Mpa压力下，以60mL/min的流速渐渐地经过流动相10～15min，赶去溶入的气体此法适用于一切的溶剂，脱气效果较好，但价钱较贵•5．真空脱气 把真空脱气安装串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的延续真空脱气此法可适用于多元溶剂体系，其构造表示图见图22-2第二节 高效液相色谱仪•〔三〕输液泵• 输液泵的种类很多，目前，多用柱塞往复泵柱塞往复泵(图22-3)任务时柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱向后运动，将贮液瓶中的液体吸入缸体如此前后往复运动，将流动相源源不断地保送到色谱柱中这种泵的容积普通只需几毫升，容易清洗及改换流动相柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响泵压普通最高可达30Mpa以上但它的输液脉动性较大是缺陷目前多采用双泵补偿法及脉冲阻尼器抑制脉动性。

按泵结合方式分为并列式与串联式，后者较多第二节 高效液相色谱仪•〔四〕梯度洗脱安装• 梯度洗脱也称溶剂程序，是指在分别过程中，随时间函数程序地改动流动相组成，即程序地改动流动相的强度〔极性、pH或离子强度等〕按多元流动相的加压与混合顺序，可分为高压与低压梯度两种洗脱安装高压梯度洗脱是利用两个输液泵分别各吸一种溶剂增压后输入梯度混合室，混合后送入色谱柱，混合比由两个泵的速度决议低压梯度洗脱是在常压下用比例阀将多种溶剂按比例混合后，再用泵增压输至色谱柱低压梯度廉价，且易实施多元梯度洗脱，目前多采用低压梯度第二节 高效液相色谱仪•〔一〕六通进样阀 • 如图22-5所示在形状a位置，用微量注射器将样品注入贮样管进样后，转动六通阀手柄至形状b，贮样管内的样品被流动相带入色谱柱贮样管的体积可按需固定六通进样阀具有进样量准确、重现性好，可带压进样等优点第二节 高效液相色谱仪•〔二〕自动进样安装 • 采用微处置机控制进样阀采样〔经过阀针〕、进样和清洗等操作操作者只需把装好样品的小瓶按一定次序放入样品架上〔有转盘式、排式〕，然后输入程序〔如进样次数、分析周期等〕，启动，设备将自行运转。

第二节 高效液相色谱仪•四、色谱分别系统• 色谱分别系统包括维护柱、色谱柱、恒温安装和衔接阀等分别系统性能的好坏是色谱分析的关键•〔一〕维护柱 • 为维护分析柱挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒，常在进样器与分析柱之间装上维护柱维护柱是一种耗费性柱，普通只需5cm左右长，在分析50～100个比较脏的样品之后需求换新的维护柱芯维护柱用分析柱的同种填料填装，但粒径要大得多，便于装填第二节 高效液相色谱仪•〔二〕色谱柱 色谱柱是由柱管和固定相组成每根柱端都有一块多孔性〔孔径1μm左右〕的金属烧结隔膜片〔或多孔聚四氟乙烯片〕，用以阻止填充物逸出或注射口带入颗粒杂质色谱柱按规格不同分为分析柱和制备型两类分析型柱，普通常量分析柱内径2～4.6mm，柱长10～25cm；半微量分析柱内径1～1.5mm，柱长10～20cm毛细管柱，内径0.05～1mm，柱长3～10cm;实验室用制备型柱，内径20～40mm，柱长10～30cm第二节 高效液相色谱仪•〔三〕柱恒温箱 柱温是液相色谱的重要参数，准确控制柱温可提高保管时间的重现性普通情况下较高柱温能添加样品在流动相的溶解度，缩短分析时间，通常柱温升高6℃，组分保管时间减少约30%；升高柱温能添加柱效，提高分别效率；分析高分子化合物或粘度大的样品，柱温必需高于室温；对一些具有生物活性的生物分子分析时柱温应低于室温。

液相色谱常用柱温范围为室温至65℃ 第二节 高效液相色谱仪 〔四〕色谱柱柱效的评价 <中国药典>2000版附录中规定，用高效液相色谱法建立分析方法时，需进展“色谱条件与系统适用性实验〞，给出分析形状下色谱柱〔应到达的〕最小实际塔板数、分别度和拖尾因子购买新柱时也需检验柱性能能否符合要求常用色谱柱柱效评价条件如下第二节 高效液相色谱仪• 硅胶柱 样品：苯、萘、联苯及菲〔用己烷配制〕；流动相：无水己烷• 反相色谱柱〔ODS柱等〕 样品：尿嘧啶〔测死时间用〕、硝基苯、萘及芴〔或甲醇配制的硅胶柱样品〕；流动相：甲醇-水(85:15, V/V)或乙腈-水(60:40, V/V)• 正相色谱柱〔氰基与氨基柱等〕 样品：四氯乙烯〔测死时间用〕、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇也可用偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯为样品；以正庚烷为流动相• 按上述条件，测得各组分的W1/2及tR，求出实际塔板数n及相邻组分的分别度R(≥1.5)第二节 高效液相色谱仪 五、 检测系统 理想的检测器应具有灵敏度高、呼应快、重现性好、线性范围宽、运用范围广、死体积小、对流动相流量和温度动摇不敏感等特性。

第二节 高效液相色谱仪• 〔一〕 紫外检测器(ultraviolet detector, UVD) • 紫外检测器是HPLC运用最普遍的检测器，也是高效液相色谱仪配置最多的检测器主要用于具有π-π或者是p-π共轭构造的化合物具有灵敏度高、精细度及线性范围较好、不破坏样品、对温度及流动相流速动摇不敏感、可用于梯度洗脱、构造简单等特点，属浓度型检测器缺陷是不适用于对紫外光无吸收的样品，流动相选择有限制〔流动相的截止波长必需小于检测波长〕，目前的仪器常用的有可变波长型及二极管阵列检测器第二节 高效液相色谱仪(一〕 紫外检测器(ultraviolet detector, UVD) 1．可变波长型检测器 相当于一台紫外－可见分光光度计，波长可按需求恣意选择，选择样品的最大吸收波长为检测波长，以添加检测灵敏度但由于光源是经过单色器分光后照射到样品上，光源强度及透射光的强度都相应减弱因此，这种检测器对光电转换元件及放大器要求都较高第二节 高效液相色谱仪•2．光电二极管阵列检测器 • 由光源发出的紫外或可见光经过检测池，所得组分特征吸收的全部波长经光栅分光、聚焦到二极管阵列上同时被检测(图22-6)，计算机快速采集数据，便得到三维色谱－光谱图，即每一个峰的紫外光谱图。

其中二极管阵列检测元件可由1024〔512或211〕个光电二极管阵列组成，可同时检测190～800nm全部紫外光和可见光的波长范围内的信号〔A-t曲线〕及每个色谱组分的光谱图〔A-λ曲线〕，即三维时间-色谱-光谱图，它可以提供关于色谱分别、定性、定量的丰富信息，可以同时得到多个波长的色谱图，计算不同波长的相对吸收比，可以在色谱分别期间，对每个色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图，并计算最大吸收波长也可以用计算机将两个谱图绘在一张三维坐标图上〔t、A、λ分别为X、Y、Z轴〕，而获得三维光谱-色谱图光光电电二极管二极管阵阵列列检测检测器器第二节 高效液相色谱仪•〔二〕 蒸发光散射检测器 〔evaporative light-scattering detector，ELSD〕 • 蒸发光散射检测器是90年代出现的新型泛用检测器这种检测器是将流出色谱柱的流动相及组分先引入通载气〔常用高纯氮〕的蒸发室，在蒸发室和漂移加热管中，流动相蒸发而除去，样品组分那么在蒸发室内构成不挥发的微小颗粒，在漂移管末端，此微粒在强光照射下产生光散射〔丁铎尔光效应〕，用光电倍增管检测到的散射光与组分的量成正比。

为防止透射光的影响，光电倍增管和入射光的角度应在90 o ～160 o，普通选用120 o，以利于丈量到衍射光的最大强度第二节 高效液相色谱仪•此检测器是一种通用型的质量检测器，对一切固体物质〔检测时〕均有几乎相等的呼应，检测限普通为8～10ng，可用于挥发性低于流动相的任何样品组分，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低ELSD可用于梯度洗脱，除可用作HPLC检测器，还可用作超临界色谱(SFC)的检测器，特别适用于无紫外吸收的样品，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、维生素及甾体类等化合物，是一种正在迅速开展中的检测器第二节 高效液相色谱仪〔三〕 荧光检测器(fluorophotometric detector, FD) 荧光检测器用于在紫外光的激发下能发荧光的化合物，或不产生荧光的物质但能利用荧光试剂在柱前或柱后衍生化制成荧光衍生物的检测在现有高效液相检测器中，灵敏度最高，比紫外检测器的灵敏度高2个数量级，选择性也好常用于酶、甾族化合物、维生素、氨基酸等成分的HPLC分析，是体内药物分析常用的检测器第二节 高效液相色谱仪六、数据记录与处置系统 数据记录与处置系统是将色谱系统的检测信号变成为下一步运用的永久性的记录的安装。

分析结果可用原始记录仪绘制谱图，数据以图表的方式打印出来，或储存在磁盘中，现已广泛运用微处置机和色谱任务站来记录和处置色谱分析的数据每次色谱分析终了，打印绘图机可当场绘出色谱图，同时标出每个色谱峰的称号、保管时间、峰高或峰面积，在计算峰面积时，可自动修正和优化色谱分析数据硬件是一台微型计算机，加上色谱数据采集卡和色谱仪器控制卡软件包括色谱仪实时控制程序，峰识别和峰面积积分程序，定量计算程序，报告打印程序等色谱任务站在数据处置方面的功能有：色谱峰的识别、基线的校正、重叠峰和畸形峰的解析，计算峰参数〔包括保管时间、峰高、峰面积、半峰宽等〕，定量计算组分含量等第二节 高效液相色谱仪• 七、 仪器性能• 色谱仪实践是由分别和检测两大部分组成，仪器性能目的应包括这两部分仪器性能主要指流量反复性、噪音、漂移、敏感度、线性、定性定量反复性紫外检测器及荧光检测器等光学检测器，还有波长精度等目的第三节第三节 高效液相色谱法的根本实际高效液相色谱法的根本实际n 来源于气相色谱过程的动力学实际——速率实际，也适用于液相色谱液相色谱中以液体作为流动相，由于液体与气体在分散系数、粘度、外表张力、密度等方面的差别，因此，主要表如今液相色谱的速率实际方程式中纵向分散项〔B/〕及传质阻力项(C)对H值的影响与气相色谱不同。

第三节第三节 高效液相色谱法的根本实际高效液相色谱法的根本实际n Van Deemter方程式用于液相色谱与气相色谱的区别，主要表如今纵向分散项〔B/〕及传质阻抗项(C)的差别上，在液相色谱中，流动相是液体，粘度(η)比气体大的多，柱温又比气相色谱低的多〔HPLC多采用室温〕，又因Dm∝T/η,因此液相色谱的Dm比气相色谱的Dm约小105倍其次，为了节约分析时间，在液相色谱中，所采用的流动相的流速，普通至少是最正确流速的3～5倍这些要素都促使纵向分散项B/减小，普通可忽略不计，于是Van Deemter方程式在HPLC中的表达式为：第三节第三节 高效液相色谱法的根本实际高效液相色谱法的根本实际n此式阐明在HPLC中，可以近似地以为流动相的流速与板高成直线关系，A为截距，C为斜率流速增大，板高添加，色谱柱柱效降低为了兼顾柱效与分析速度，普通都尽能够地采用较低流速内径4.6mm柱，流量多采用1mL/minn流动相的流速对GC与HPLC板高影响的差别如图 第三节第三节 高效液相色谱法的根本实际高效液相色谱法的根本实际n由图22-9可知：①当u＜u最正确时，B/u项对板高起主要作用，即u越小，柱效越低；②当u＞u最正确时，Cu项对板高起主要作用，即流速〔u〕越大，柱效越低；③当u=u最正确时，分子分散项〔B/u〕对板高的奉献可以忽略。

由H最小可以看出，HPLC比GC有更高的柱效由低的u最正确值可看出H-u曲线有平稳的斜率，阐明要用高的液体流速时，柱效无明显损失第三节第三节 高效液相色谱法的根本实际高效液相色谱法的根本实际n从涡流分散项与传质阻抗项对HPLC柱效的影响可以以为：为了使A减小，提高色谱柱柱效，可从两方面采取措施：①降低dp采用小粒度固定相，直径越小，A越小，以前多用10μm固定相，目前商品柱多采用3～5μm粒径的固定相②降低λ采用球形、颗粒度分布〔RSD<5%〕固定相球形固定相，除了能降低λ外，还能添加柱浸透性，降低柱压3～5μm球形固定相，柱效普通为8～5×104/m，可高达1×105/m n传质阻抗项是传质阻抗系数与流动相流速之积.传质阻抗系数在HPLC中与在GC不同,在HPLC中传质阻抗系数由3个系数组成nC = Cm + Csm + Cs n式中, Cm 、Csm 及Cs分别是组分在流动相、静态流动相和固定相中的传质阻抗系数由于通常都采用化学键合相，它的“固n 定液〞是键合在载体外表固定液官能团的单分子层因此，固定液的传质阻抗可以忽略于是nC = Cm + Csm n由此得到HPLC最常见的Van Deemter方程式的表现方式nH = A + Cm + Csm n此式阐明：HPLC色谱柱的实际塔板高度，主要由涡流分散项、n 流动相传质阻抗项和静态流动相传质阻抗项三项所构成。

第三节第三节 高效液相色谱法的根本实际高效液相色谱法的根本实际 Van Deemter方程式所获得的降低板高提高柱效的方法可概括为：①采用小粒度、窄分布的球形固定相，首选化学键合相；②采用低粘度流动相，低流量〔1mL/min〕；③柱温以25～30℃为宜太低，那么使流动相的粘度添加，温度高易产生气泡第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p一、分配色谱p分配色谱法〔partition chromatography 〕又称液-液分配色谱法〔liquid-liquid partition chromatography〕,是根据物质在固定相和流动相之间相对溶解度的不同，而在两相间进展不同分配实现分别的方法分配系数较大的组分，保管值也较大第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p (一)正相分配色谱法p流动相极性小于固定相极性，称为正相分配色谱法〔mormal phase partition chromatography〕，它对于极性强的组分有较大的保管值，常用于分别强极性化合物由于以含水硅胶为固定相，固定液易流失，现已采用正相键合相色谱替代，常用氰基或氨基化学键合相。

p氰基键合相以硅胶作载体，用氰乙基取代硅胶的羟基，构成氰基化学键合相，其分别选择性与硅胶类似，但极性小于硅胶分别机制主要靠诱导作用力，分别对象主要是可诱导极化的化合物或极性化合物 第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p(一)正相分配色谱法p氨基键合相是用丙氨基取代硅胶的羟基而成，与硅胶性质有较大差别，前者为碱性，后者为酸性，因此具有不同的选择性分别机制主要为诱导作用力和氢键作用力，主要用于分析糖类物质由于固定相是极性填料，流动相常选用低极性溶剂如烃类，参与适量极性溶剂、醇类等调理洗脱液梯度洗脱时，通常逐渐增大洗脱剂中极性溶剂的比例，故样品中极性小的组分先流出，极性大的组分后流出第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p(二)反相分配色谱法p流动相极性大于固定相极性的称为反相分配色谱法〔reversed phase partition chromatography〕它对于极性弱的组分有较大的保管值，适宜于分别弱极性的化合物极性大的组分先流出，极性小的组分后流出将各种不同有机基团经过化学反响共价键合到硅胶〔担体〕外表的游离羟基上，构成化学键合固定相，取代了机械涂渍的液体固定相。

第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p 典型的反相键合相色谱是将十八烷基键合在硅胶外表所得的SOD柱上，采用甲醇－水或乙腈－水作流动相，分别非极性和中等极性的化合物其分别机制常用疏溶剂实际来解释当非极性溶质或溶质分子中的非极性部分进入到极性流动相中时，由于疏溶剂效应，分子中的非极性部分与极性溶剂分子间产生排斥力，和键合相的烃基产陌生溶剂缔合此时溶质的保管主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力非离子型溶质分子与键合相非极性烃基间的缔合反响是可逆的流动相的外表张力越高，缔合力越强反之，假设溶质分子有极性官能团存在时，那么与极性溶剂间的作用力 加强，而不利于缔合第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p二、 吸附色谱p吸附色谱法〔adsorption chromatography〕又称液-固吸附色谱法(liquid-solid adsorption chromato-graphy)，是根据被分别组分的分子与流动相分子争夺吸附剂外表活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分别适宜于分别相对分子质量中等的油溶性样品，在常用的几种高效液相色谱法中，吸附色谱法是分别异构体的最好方式。

第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p三、离子交换色谱p 离子交换色谱〔ion exchange chromatography, IEC〕是以离子交换剂为固定相，用缓冲液为流动相，根据选择性差别而分别的方法早期采用高分子聚合物，如苯乙烯二乙烯苯为基体的离子交换树脂为固定相，由于遇溶剂膨胀、不耐压以及外表的微孔型构造影响传质速率等弱点，已被键合离子交换剂〔离子型键合相〕所替代键合离子交换剂多以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，外表经化学反响键合上各种离子交换基团强酸性磺酸型〔-SO3H〕与强碱性季铵盐型〔-NR3Cl〕键合相，分别为常用阳离子与阴离子交换剂第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p三、离子交换色谱p 离子交换色谱广泛运用在生物医学领域里，如氨基酸分析、肽和蛋白质的分别也可作为有机和无机混合物的分别，还可作为对水、缓冲剂、尿、甲酰胺、丙烯酰胺的纯化手段，从有机物溶液中去除离子型杂质等第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p四、离子色谱p 离子色谱法〔ion chromatography ,IC〕是离子交换色谱法的最重要进展，固定相为离子交换树脂，流动相为电解质溶液，通常以电导检测器为通用检测器。

离子色谱法分为化学抑制型离子色谱法〔双柱离子色谱法〕和非抑制型离子色谱法〔单柱离子色谱法〕两大类第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p 以典型的双柱离子色谱法，简要阐明其检测原理及特点该法是用两根离子交换柱，一根为分析柱，另一根为抑制柱，两根色谱柱串联，用电导检测器检测由于抑制柱装有与分析柱相反的离子交换剂，因此高浓度的酸、碱洗脱液〔流动相〕经过抑制柱后变为水，消除了其高电导本底，以利于对样品离子信号的检测另一特点是离子色谱仪的泵及流路等，用耐腐蚀资料制成p 离子色谱法运用很广，不但可以分析无机与有机阴、阳离子，而且可以分析氨基酸，以及糖类和DNA、RNA的水解产物等离子色离子色谱仪谱仪第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p五、离子对色谱p 在固定相上涂渍或流动相中参与溶质分子电荷相反的离子对试剂，进展分分别子型或可离子化的化合物的方法称为离子对色谱法〔ion pair chromato-graphy，IPC〕或离子对色谱〔paired ion chromato-graphy, PLC〕，是由离子对萃取开展而成的一种分别分析的方法。

第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p离子对萃取是一种液液分配分分别子型化合物的技术，这种萃取方法是选择适宜的反电荷离子参与到水相中，与被分别化合物构成离子对，离子对表现为非离子性的中性物质，被萃取到有机相中 p离子对色谱法分为两类：正相离子对色谱和反相离子对色谱法如今最常用的是反相离子对色谱，它运用反相谱中常用的固定相〔如ODS〕，能同时分分别子型化合物和中性化合物第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p反相离子对色谱常用非极性疏水固定相，在强极性溶剂中参与与被分分别子电荷相反的平衡离子〔如B-〕，当样品〔含有被分别的离子A+〕进入色谱柱之后，A+和B-相互作用生成中性化合物AB，AB就会被疏水性固定相溶解或吸附，按照它和固定相及流动相之间的作用力大小被流动相洗脱下来 第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p常用的流动相是甲醇-水和乙腈-水，添加甲醇或乙腈，k值减小在流动相中添加有机溶剂的比例，应思索离子对试剂的溶解度流动相酸度对保管值的影响，普通pH在2～7.4比较适宜p离子对试剂的种类，大小及浓度都对分别有很大的影响，选择离子对试剂的种类决议于被分别样品的性质。

第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法反相离子对色谱在许多领域中得到运用，如无机阴离子、阳离子、生物碱、维生素、抗菌素以及其它药物的分析，在生物化学、石油化工等方面也有很多运用第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p六、尺寸排阻色谱p尺寸排阻色谱〔size exclusion chromatography, SEC〕用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分别SEC是快速分别不同分子量混合物的色谱方法，可以快速地确定样品混合物的复杂组分，并同时给出各个组分的大约分子量及分布第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p常用的流动相有四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、邻二氯苯、间甲酚、缓冲溶液等第四节第四节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法p七、胶束色谱p以胶束水溶液为流动相的色谱法称为胶束色谱法〔micellar chromatography, MC〕p由于在流动相中又添加了一相〔胶束相〕，故又称为假相色谱该系统具有：固定相-流动相-胶束-固定相，三个界面、三个分配系数，因此有较好的选择性其次是胶束水溶液无毒、廉价、平安。

第五节 固定相v色谱柱是高效液相色谱的心脏，其中的固定相〔stationary phase或称为填充剂、填料〕，是保证色谱柱高柱效和高分别度的关键高效液相色谱法对固定相的要求比气相色谱法高得多主要类型的固定相有硅胶、化学键合相、离子交换剂等 一、硅 胶v是液-固吸附色谱常用的固定相之一分为表孔硅胶、无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶及堆积硅珠等类型 v外表多孔型硅胶粒度约为30～70μm，现已很少运用无定形全多孔硅胶约5～10μm，球形全多孔硅胶约为3～10μm，堆积硅珠约为3～5μmv硅胶的主要性能参数有：外形、粒度、粒度分布、比外表积及平均孔径等v硅胶是运用很广的固定相，主要用于分别溶于有机溶剂的极性至弱极性的分子型化合物也可用于分别某些几何异构体二、化 学 键 合 相v二、化学键合相v 〔一〕非极性键合相v 〔二〕中等极性键合相v 〔三〕极性键合相二、化 学 键 合 相v 用化学反响的方法将固定液的官能团键合在载体外表上，所构成的填料称为化学键合相〔chemically bonded phase〕，简称键合相。

化学键和固定相的优点是无固定液流失，添加了色谱柱的稳定性和运用寿命；化学性能稳定，在pH2～8的溶液中不蜕变；传质过程快，柱效高；载样量比硅胶约大一个数量级；适于作梯度洗脱v 化学键合固定相兼有分配作用和一定的吸附作用，吸附作用的大小视键合覆盖率而定用化学反响方法将载体外表上残存的硅醇基除去，称为封尾、封顶或遮盖，所构成键合相称为封尾键合相这种键合相没有吸附作用，强疏水是其缺陷二、化 学 键 合 相v化学键合相不仅可用于正相色谱、反相色谱，还用于离子对色谱、离子交换色谱等特别是反相化学键合相色谱运用最广按固定液〔基团〕与载体〔硅胶外表Si-OH基团〕相结合的化学键类型，主要可分为硅氧碳键型〔≡Si-O-C〕与硅氧硅碳键型 (≡Si-O-Si-C)≡Si-O-C型键合相因易发生水解或与酯发生交换反响而损坏，已淘汰Si-O-Si-C型稳定性好，容易制备是目前运用最广泛的键合相按极性可分为非极性、中等极性与极性三类反相色谱常用非极性和中等极性键合相极性键合相为正相色谱所用二、化 学 键 合 相v〔一〕非极性键合相v这类键合相外表基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基等。

v运用最广的十八烷基键合相〔ODS或C18〕是由十八烷基氯硅烷试剂与硅胶外表的硅醇基，经多步反响脱HCl生成ODS键合相键合反响表示如下：二、化 学 键 合 相v 1．载体性质 多数产品采用全多孔YWG(液相、无定形、硅胶)、YQG〔液相、全多孔、硅胶〕或堆积硅珠作为ODS键合相的载体载体的比外表决议键合基团的总量，总量大，k大，保管时间长涡流分散项与柱浸透性，取决于载体的外形，以球形为好按载体不同分为各种型号国产品：YWG-C18H37(5、10μm)、YQG-C18H37(堆积硅珠，3～5μm)及YWG-C6H5(5、10μm)等固定相代号的前部为载体，后部为官能团进口品：Nucieosil C18〔球形，3μm或5μm〕及Zorbax-ODS〔球形，5μm〕等二、化 学 键 合 相v 2．外表覆盖度 在硅胶外表，每平方纳米约有6个硅醇基可供化学键合由于键合基团的立体构造妨碍，使这些硅醇基不能全部参与键合反响外表覆盖度的大小〔参与反响的硅醇基数目占硅胶外表硅醇基总数的比例〕，决议键合相是分配还是吸附占主导Partisil 5-ODS外表覆盖度为98%，即残存2%的硅醇基，分配占主导。

例Partisil 5-ODS外表覆盖度为50%，既有分配又有吸附作用封尾键合相只需分配作用，如国内产品YWG-FN是用氟酰胺遮盖了硅胶的吸附部位，分别效果良好，但疏水性强在同样分别条件下，柱压高于普通键合相柱二、化 学 键 合 相v3．键合基团的链长 链长添加，极性降低，载样量增大，k值增大，如C18基团大于C8ODS键合相最大允许载样量为每克固定相2×10-3g〔二〕中等极性键合相v常见的有醚基键合相〔代号ETH或ROR〕这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定国产品如YWG-ROR’(5、10μm)进口品如Permaphase-ETH〔表孔硅胶、25～37μm〕 〔三〕极性键合相v常用极性键合相为氨基键合相〔强极性〕、氰基键合相〔中强极性〕，是分别将氨丙硅烷基[-Si(CH2)3NH2]及氰乙硅烷基[-Si(CH2)2CN]键合在硅胶上而制成它们可用作正相色谱的固定相〔三〕极性键合相v氨基键合相是分析糖类最常用的固定相，常用乙腈-水为流动相，而不用烷烃，由于糖不溶解于烷烃氰基键合相的分别选择性与硅胶类似，但极性比硅胶弱因此，在一样流动相条件下的保管值较硅胶小。

假设要维持类似的保管值，那么需用极性更小的流动相洗脱许多能在硅胶上分别的样品，可以在氰基键合相上完成氰基键合相对双键异构体有很好的分别选择性〔三〕极性键合相v国产品：YWG-CN及YWG-NH2 (5μm或10μm)；v YQG-CN及YQG-NH2〔5μm或10μm〕v进口品：Lichrosorb CN(无定形，10μm)、v Zorbax-CN(球形，4～6μm)等v此处引见的化学键合相是用于反相与正相色谱的化学键合相广义的化学键合相，还包括键合型离子交换剂、手性固定相及亲合色谱固定相等三、凝 胶v尺寸排阻色谱法常用的固定相为具有一定孔径范围的多孔性凝胶所谓凝胶是含有大量液体〔普通是水〕的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立体网状构造的多聚体根据强度，这类凝胶可分为软质、半硬质及硬质三种软质凝胶在压强0.1MPa左右即被压坏，因此这类凝胶只适用于常压下的分子排阻色谱法，不适用于高效液相色谱三、凝 胶v〔一〕半硬质凝胶 由苯乙烯和二乙烯苯交联而成，颗粒直径约10μm，外表是非极性的，适用于以非极性有机溶剂为流动相的凝胶浸透色谱。

优点是具有可紧缩性，填得严密，柱效高缺陷是醇类、丙酮等极性溶剂对其有溶胀效应，不宜运用三、凝 胶v〔二〕硬质凝胶 有多孔硅胶及多孔玻璃珠等，它主要为无机资料其优点是在有机溶剂中不变形，孔径尺寸固定，溶剂互换性好缺陷是装柱时较易碎，不易装紧，因此柱效较低，普通为有机胶的1/3～1/4它的吸附性较强，有时易拖尾三、凝 胶v 〔三〕凝胶的主要性能参数 凝胶的分子量排斥极限和平均孔径是凝胶性能的主要参数v 凝胶的分子量排斥极限〔或分子量范围〕是指指定的高分子化合物到达某分子量后，而不能进入凝胶的一切孔径，此时的分子量称为该凝胶的分子量排斥极限选择凝胶时，必需使样品的分子量小于凝胶的分子量排斥极限而大于全浸透点的分子量，即使样品的分子量落入凝胶的“分子量范围〞否那么，tR〔或VR〕将不随分子量而变化四、离子交换剂v常用的离子交换剂包括离子交换树脂和离子交换键合相两类离子交换色谱法早期采用离子交换树脂作固定相因这种固定相具有膨胀性、不耐压，以及外表的微孔构造影响传质速率，已被离子型键合相所替代四、离子交换剂v最常见的离子型键合相是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，其外表经化学键合上所需的各种离子交换基团。

按键合离子交换基团可分为阳离子键合相〔强酸性和弱酸性〕，常用强酸性磺酸型交换基为亚硫酸基〔-SO3H〕；阴离子键合相〔强碱性和弱碱性〕，常用强碱性季铵盐型交换基为季铵盐〔-NR3Cl〕四、离子交换剂v常用国产的离子交换键合相有YWG-SO3H、YWG-R3NCl、YSG-SO3Na及YSG- R3NCl进口品有Zipax-SAX〔系薄壳载体强阴离子键合相〕、Lichrosorb Si 100 SCX〔全多孔无定形强阳离子键合相〕、Zipax-SCX〔薄壳型阳离子键合固定相〕、Zipax-WAX及Zipax-WCX〔分别为薄壳载体弱阴离子及弱阳离子键合固定相〕等第六节 流 动 相uu在液相色谱中，流动相可以从有机溶剂到水溶液，既能用纯溶剂，也可用二元或多元混合溶剂流动相溶剂的性质和组成对色谱柱效、分别选择性和组分的k值影响很大改动流动相的性质和组成，是提高色谱系统分别度和分析速度的重要手段一、流动相选择的普通要求〔一〕化学惰性好如液〔一〕化学惰性好如液- -液分配色谱中用作流动液分配色谱中用作流动相的溶剂应与固定相不互溶，高纯度，以防所含微量相的溶剂应与固定相不互溶，高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改动。

液固色谱中，杂质在柱中积累，引起柱性能的改动液固色谱中，硅胶吸附剂不能用碱性溶剂〔如胺类〕；氧化铝吸附硅胶吸附剂不能用碱性溶剂〔如胺类〕；氧化铝吸附剂不能用酸性溶剂剂不能用酸性溶剂 〔二〕选用的溶剂性能应与所运用的检测器相互匹〔二〕选用的溶剂性能应与所运用的检测器相互匹配如运用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长配如运用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长有紫外吸收的溶剂有紫外吸收的溶剂一、流动相选择的普通要求〔三〕溶剂对样品有足够的溶解才干，以提高测定的灵敏度，同时防止在柱头产生沉淀〔四〕选择的溶剂应具有低的粘度和适当低的沸点运用低粘度溶剂，可减少溶质的传质阻力，利于样品的纯化〔五〕应尽量防止使器具有显著毒性的溶剂，以保证操作人员的平安一、流动相选择的普通要求一、流动相选择的普通要求二、常用流动相溶剂的性质 〔一〕沸点(b.p) 〔二〕粘度(η) 〔三〕互溶性 〔四〕流动相溶剂的极性二、常用流动相溶剂的性质〔 〔一一〕 〕沸点沸点(b.p) (b.p) 大部分可供大部分可供选选用的溶用的溶剂剂沸点沸点较较低，低，这样这样便于回收分便于回收分别样别样品。

在品在LC-MSLC-MS联联用技用技术术中，低沸点溶中，低沸点溶剂剂不适用于往复不适用于往复泵泵，容，容易在易在泵泵体构成气泡，影响体构成气泡，影响泵泵的的输输液精度〔 〔二二〕 〕粘度粘度(η) (η) 随溶随溶剂剂粘度添加，粘度添加，传质传质速率降低，柱效下降在柱速率降低，柱效下降在柱压压降降〔 〔ΔPΔP〕 〕一定一定时时，流，流动动相相线线速度与其粘度成反比，速度与其粘度成反比，应应尽能尽能够选够选用低用低粘度溶粘度溶剂剂除采用水溶液的离子交除采用水溶液的离子交换换色色谱谱外，外，坚坚持溶持溶剂剂粘度低于粘度低于0.40.4～～0.50.5厘泊厘泊〔 〔cPcP〕 〕是不困是不困难难的〔 〔三三〕 〕互溶性互溶性 在采用二元混合溶在采用二元混合溶剂时应剂时应思索溶思索溶剂剂的互溶性，防止溶的互溶性，防止溶剂剂分分层层二、常用流动相溶剂的性质uu〔 〔四四〕 〕流流动动相溶相溶剂剂的极性的极性uu高效液相色高效液相色谱谱中的流中的流动动相由于它在两相分配相由于它在两相分配过过程中程中起着重要作用，起着重要作用，为为了描画它和溶了描画它和溶质质作用力的大小，作用力的大小，有必要有必要对对流流动动相的相的综协综协作用力作用力给给以定量的表示，即以定量的表示，即““极性〞。

在高效液相色极性〞在高效液相色谱谱中常用中常用RohrschneiderRohrschneider的的数据来描画溶数据来描画溶剂剂的极性，以极性参数的极性，以极性参数P′P′表示，表表示，表22-522-5中列出常用溶中列出常用溶剂剂的的P’,P’,其中水的极性最大在其中水的极性最大在正相色正相色谱谱中，中，P′P′越大，洗脱才干越越大，洗脱才干越强强，在反相色，在反相色谱谱中，中，P′P′越大，洗脱才干越弱越大，洗脱才干越弱调调理溶理溶剂剂极性可使极性可使样样品品组组分的容量因子在适宜范分的容量因子在适宜范围围普通粗略的普通粗略的说说P′P′值值改改动动2 2个个单单位，位，k k就改就改动动1010倍二、常用流动相溶剂的性质uu在色在色谱谱分析中流分析中流动动相相经经常由两种或两种以上不同常由两种或两种以上不同的溶的溶剂组剂组成这这种混合溶种混合溶剂剂的极性是由它的各种的极性是由它的各种组组分根据其所占份分根据其所占份额额而奉献的极性之和构成如而奉献的极性之和构成如A A和和B B两两组组分分组组成混合溶成混合溶剂剂，其极性参数可由下式，其极性参数可由下式计计算：算：uu uu 式中和分式中和分别为别为混合溶混合溶剂剂中中A A和和B B所占的体所占的体积积分数，分数，Pa′Pa′和和Pb′Pb′分分别为别为A A和和B B的极性参数。

的极性参数二、常用流动相溶剂的性质uu在吸附色在吸附色谱谱中中还还可以运用溶可以运用溶剂剂强强度参数度参数ε0ε0表示流表示流动动相溶相溶剂剂极性ε0ε0值值越大，洗脱才干越越大，洗脱才干越强强调调理溶理溶剂剂极性可使极性可使样样品品组组分的分的k k值值在在顺应顺应范范围围对对正相色正相色谱谱、、二元溶二元溶剂剂的极性参数和的极性参数和组组分分k k值值有如下关系：有如下关系：uu对对反相色反相色谱谱那么那么为为uu = =uu式中，和分式中，和分别为别为初始和初始和调调整后二元溶整后二元溶剂剂的极性参数；的极性参数；k1k1和和k2k2那么那么为组为组分相分相应应的容量因子的容量因子二、常用流动相溶剂的性质uu例例 在一反相色在一反相色谱谱柱上，流柱上，流动动相相为为3030％甲醇和％甲醇和7070％水％水〔 〔体体积积比比〕 〕时时，，某某组组分的保管分的保管时间为时间为25.6min25.6min，死，死时间为时间为0.35min0.35min，如何，如何调调整溶整溶剂剂配比使配比使k≥5k≥5uu 解：解：uu即即调调整溶整溶剂剂比例比例uu为为7575％甲醇和％甲醇和2525％水，％水，uu使使k k＝＝5 5。

三、溶剂的选择性与分类 uuRohrschnieder和McReynold曾运用五或十种实验溶质在气相色谱固定液上保管值不同来测定气相色谱固定液的分别选择性根据类似原理，Synder将溶剂和样品分子间的作用力作为溶剂选择性分类的根据，并将溶剂选择性参数分为3类：溶剂接受质子、给予质子和偶极作用的才干三、溶剂的选择性与分类 uu根据3类选择性参数Xe〔质子接受体〕、Xd〔质子给予体〕、Xn〔强偶极矩〕，将用于液相色谱的81种溶剂的Xe，Xd ，Xn值作成三角坐标图〔图22-12〕，按具有类似选择性原那么进展选择性分类可分为8组溶剂例如，Ⅰ组溶剂的Xe较大，是纯质子接受体，如乙醚见〔表22-5〕，Ⅴ是强偶极中性化合物，Ⅷ是质子给予体等三、溶剂的选择性与分类 三、溶剂的选择性与分类 根据溶剂的性质和图22-12溶剂选择性分类，各选择性组大致包括如下一些溶剂Ⅰ组：脂肪醚〔纯质子接受体〕；Ⅱ组：脂肪醇〔质子接受-给予体〕；Ⅲ组：吡啶衍生物、四氢呋喃〔质子接受体，易极化〕；Ⅳ组：乙二醇、乙酸、甲酰胺；Ⅴ组：二氯甲烷、二氯乙烷〔大偶极矩〕；Ⅵ组：脂肪酮、酯、二氧六环；Ⅶ组：芳烃、芳醚、硝基甲烷；Ⅷ组：氟代醇、氯仿、水〔质了给予体〕。

各种同系物属同一个选择性组三、溶剂的选择性与分类uu从图22-12可以看到，Ⅰ、Ⅴ、Ⅷ三组溶剂间隔最远由一组溶剂变换到另一组溶剂，将发生最大的选择性变化，如正相色谱由三氯甲烷〔Ⅷ〕变为乙醚〔Ⅰ〕的情况uu同一组溶剂在分别中具有类似的选择性，不同组别的溶剂，其选择性差别较大采用不同组别的溶剂，可显著改动溶剂的选择性四、不同色谱方式选用的流动相( (一一) )吸附色吸附色谱谱用流用流动动相相 对对于常用硅胶作吸附于常用硅胶作吸附剂剂的液固吸附色的液固吸附色谱谱中，改中，改动动溶溶剂剂即可即可得到适宜的得到适宜的k k以硅胶为为吸附吸附剂时剂时一些溶一些溶剂剂的的ε0ε0参参见见表表22-522-5假设选设选用初始溶用初始溶剂剂太太强强，使，使样样品品组组分的分的k k值过值过小，小，那么可由表中那么可由表中选值选值ε0ε0较较小的溶小的溶剂剂来替代；反之，假来替代；反之，假设样设样品品组组分分k k值值太大，那么太大，那么选选ε0ε0较较大的溶大的溶剂剂通常吸附色通常吸附色谱谱运用二元混合溶运用二元混合溶剂剂作流作流动动相，可使溶相，可使溶剂剂强强度度随其随其组组成延成延续续改改动动，可以，可以获获得最正确的分得最正确的分别选择别选择性。

假性假设设混合溶混合溶剂剂中中强强极性溶极性溶剂剂的含量占的含量占绝对优势绝对优势或含量很低，或含量很低，其分其分别别因子因子α α呈呈现现最大最大值值运用混合溶运用混合溶剂剂的另一个的另一个优优点点是可使流是可使流动动相相坚坚持低的粘度，并可持低的粘度，并可坚坚持高的柱效持高的柱效 四、不同色谱方式选用的流动相(一)吸附色谱用流动相 吸附色谱中，样品的α值的改动可在等溶剂强度〔ε0不变〕下，用不同性质的溶剂交换强溶剂来实验，找到最适宜的流动相选择不同溶剂时，除思索ε0值外，还应思索试样分子与溶剂分子间的氢健作用等要素因吸附色谱分别机制和薄层色谱一样，可以薄层色谱作先导实验来确定液固色谱的最优分别条件四、不同色谱方式选用的流动相(二)分配色谱用流动相 1．正相分配色谱 正相色谱的固定相是极性的，故添加溶剂的，可添加洗脱才干，使组分k值下降选择适宜值的溶剂，使样品k值在1～10范围内，通常在饱和烷烃，流动相主体为己烷、庚烷，可参与<20%的极性改性剂如正己烷中参与极性溶剂，调理极性溶剂的比例使能到达理想的k值假设分别的选择性不好，那么改用其他组别的溶剂类改善选择性假设二元溶剂不行，还可思索运用三元或四元溶剂体系。

四、不同色谱方式选用的流动相(二)分配色谱用流动相 2、反相分配色谱 反相色谱固定相是非极性的，所以溶剂的极性添加，洗脱才干添加，样品的k值添加运用的流动相类似于液固色谱法中运用非极性吸附剂时运用的流动相此时流动相的主体为水，参与<10%的改性剂，如二甲基亚砜、乙二醇、乙腈、甲醇、对二氧六环、乙醇、四氢呋喃、异丙醇等四、不同色谱方式选用的流动相(二)分配色谱用流动相 2、反相分配色谱 溶质在混合溶剂流动相中的容量因子k会随改性剂的参与而减小，阐明混合溶剂的洗脱强度加强普通以水和甲醇或乙腈组成二元溶剂，已可以满足多数分别要求有时也可参与适当的酸或碱来控制流动相的pH值，以防止出现不对称色谱峰反相色谱常采用梯度洗脱，使每个组分都在适宜条件下获得分别四、不同色谱方式选用的流动相(三)离子交换色谱 离子交换色谱流动相常用含盐的水溶液〔缓冲溶液〕，有时参与适量的有机溶剂如甲醇、乙腈等，以添加某些组分的溶解度溶剂强度和选择性与盐的类型、浓度、pH值以及参与的有机溶剂的种类和浓度有关四、不同色谱方式选用的流动相(四)尺寸排阻色谱 排阻色谱和其他方法不同之处是，不用采取改动流动相组成的方法来控制分别度。

应选择流动相仅需思索能很好溶解样品，粘度要低，要与柱填料匹配为减少样品和填料外表之间的相互作用〔除了排阻色谱保管作用之外〕，如填料吸附作用和离子交换作用等，可采用控制流动相pH值和离子强度来处理第七节 HPLC分析条件的选择一、分别条件的选择〔一〕分别方法的选择 HPLC可供选择的固定相及流动相选择都有本身的特点和运用范围，选择分别类型应根据分别分析的目的、试样的性质和量的多少、现有设备条件等来确定最适宜分别条件对于不同的样品分别方式的选择可参见以下图第七节 HPLC分析条件的选择一、分别条件的选择〔二〕梯度洗脱 根据分别度的要求，在色谱分别过程中样品组分的k值范围应控制在1～10之间假设样品组分较少、性质差别不大，普通采用等度洗脱〔isocratic elution〕〔溶剂组成与配比在一分析周期内坚持恒定〕可以使一切组分的k值都处于这个范围内但是对于组分数目较多、性质相差较大的复杂混合物，采用等度洗脱时，所选择的溶剂强度对于一些组分不是太强就是太弱，其结果是弱保管组分很快流出，色谱峰尖而重叠在一同；强保管组分流出很慢，峰宽且矮平，有的甚至无法检测一、分别条件的选择〔二〕梯度洗脱 为使复杂混合物中的各组分均得到称心的分别，必需采用梯度洗脱〔gradient elution〕技术，即在一个分析周期中，程序控制流动相的组成〔如溶剂的极性、离子强度、pH值等〕改动，使每个组分都在适宜的条件下获得分别。

梯度洗脱在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温一、分别条件的选择〔二〕梯度洗脱 梯度洗脱可以采用二元混合溶剂或多元混合溶剂，即所谓二元梯度和多元梯度在整个分别过程中，溶剂强度延续变化，这种变化是按一定程序进展的强度延续变化的溶剂是经过弱溶剂A和强溶剂B混合得到的开场B的浓度很低，然后逐渐提高B的浓度溶剂混合比例及一定比例下的洗脱时间均由程序控制这样可以使不同极性的组分都可以在比较适宜的分配比下经过色谱柱，使各组分都有适宜的出峰时间一、分别条件的选择〔二〕梯度洗脱梯度洗脱特别适用于极性范围很宽的混合物分别它的主要优点是：①缩短总分析时间； ②提高分别度，是使k值相差103～104的样品组分，在合理分析速度下得到适当分别度的独一方法；③改善峰形，提顶峰的对称性，减少峰的区域宽度，使微量组分易被检出，降低最小检出量，提高检测灵敏度但梯度洗脱也有缺乏之处，如经常会引起基线漂移，且梯度洗脱的重现性较差 二、检测器的选择uu 高效液相色谱的检测器种类很多，针对样品的性质高效液相色谱的检测器种类很多，针对样品的性质不同可以选择适宜的检测器紫外检测器有比较高的灵不同可以选择适宜的检测器。

紫外检测器有比较高的灵敏度，但是只能检出在仪器特定波长下有吸收的化合物敏度，但是只能检出在仪器特定波长下有吸收的化合物主要用于芳烃与稠环芳烃、芳香基取代物、芳香氨基酸、主要用于芳烃与稠环芳烃、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羧基与羰基化合物等蒸发光散射检核酸、甾体激素、羧基与羰基化合物等蒸发光散射检测器可用于挥发性低于流动相的任何样品组分，但对于测器可用于挥发性低于流动相的任何样品组分，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低主要用于糖类、有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低主要用于糖类、高分子化合高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物荧光高分子化合高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物荧光检测器只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质检测器只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测电化学发光检测器，对于电活性物质来说是等的检测电化学发光检测器，对于电活性物质来说是一类较好的选择性检测器主要用于有机胺类化合物一类较好的选择性检测器主要用于有机胺类化合物三、色谱条件的评价uu〔一〕色谱柱的实际板数〔n〕 在选定的形状下，注入供试品溶液或各种类项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保管时间tR〔以分钟或长度计，下同，但应取一样单位〕和半峰高宽〔Wh/2〕，按n＝5.54〔tR/ Wh/2〕2计算色谱柱的实际板数。

三、色谱条件的评价uu〔二〕分别度〔二〕分别度 定量分析时，为便于准确丈量，要求定定量分析时，为便于准确丈量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分别度分别度〔量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分别度分别度〔R R〕的计算公式为：〕的计算公式为：uu式中，式中，tR2tR2为相邻两峰中后一峰的保管时间；为相邻两峰中后一峰的保管时间；tR1tR1为相为相邻两峰中前一峰的保管时间；邻两峰中前一峰的保管时间；W1W1、、 W2 W2为此相邻两峰为此相邻两峰的峰宽分别度应大于的峰宽分别度应大于1.51.5uu 三、色谱条件的评价〔三〕反复性 样品的对照溶液，延续进样5此，除另有规定外，其峰面积丈量值的相对规范偏向应不大于2.0％也可按照各样品校正因子测定项下，配置80％、100％、120％的对照溶液，参与规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对规范偏向也应不大于2.0％ 三、色谱条件的评价〔四〕拖尾因子 为保证丈量精度，特别当采用峰高法丈量时，应检查待测峰的拖尾因子〔T〕能否符合规定，或不同浓度进样的校正因子误差能否符合要求。

拖尾因子计算公式为： 式中，W0.05h为0.05峰高处的峰宽；d1为峰极大至峰前沿之间的间隔除另有规定外，T应在0.95～1.05之间第八节 定性与定量分析一、定性分析〔一〕利用保管值定性 利用对照品和样品的保管时间或相对保管时间一样性进展定性分析，方法虽然简单，但必需是知物普通用HPLC法作定性分析需改动流动相后，再次测定保管值进展比较，从而可添加定性分析的可靠性第八节 定性与定量分析一、定性分析〔二〕化学鉴定法 利用专属性化学反响对分别后搜集的组分定性由于用制备HPLC搜集组分比GC容易，因此该法是较适用的方法之一官能团鉴定试剂与气相色谱的官能团试剂一样第八节 定性与定量分析〔三〕联用技术鉴定法 这种连用技术是指HPLC作为制备手段得纯组分，后用光谱仪器鉴定此联用法是指色谱仪与光谱仪的“非〞联用详细操作方法是当相邻组分的分别度足够大时，分别搜集各组分的洗脱液，除去流动相，获得纯组分用IR、MS、NMR等分析手段鉴定IR与MS需样量约1mg，NMR需样量较大，普通需3mg以上采用两谱联用仪测定能同时获得定性、定量分析信息因此，用高效液相色谱-光谱联用仪鉴定色谱组分是当今最重要的分析鉴定手段。

重要的两谱联用仪有HPLC-UV、HPLC-FTIR及HPLC-MS等 第八节 定性与定量分析二、定量分析 液相色谱法的定量方法根本上与气候色谱方法一样，常用外标法及内标法，也可用内加法、校正因子法定量第八节 定性与定量分析二、定量分析 〔一〕外标法 以试样的对照品作规范物质，与规范物质对比求算试样含量的方法称为外标法外标法可分为外标任务曲线法、外标一点法及外标二点法等，前二种方法常用外标法的优点是不需求知道校正因子，只需被测组分出峰、无干扰、保管时间适宜，即可进展定量分析缺陷，进样量必需准确，否那么定量误差大在HPLC中，因进样量较大，或者用六通阀定量环进样，进样量误差相对较小，因此外标法是HPLC常用的定量分析方法之一详细方法同气相色谱法 第八节 定性与定量分析二、定量分析 〔二〕内标法 将一定量的内标物参与到样品中，再经色谱分析，根据样品的分量和内标物分量以及待测组分峰面积和内标物的峰面积，就可求出待测组分的含量内标法可分为任务曲线法、内标一点法〔内标对比法〕、内标二点法及校正因子法所用的内标物的要求同气相色谱内标法的优点是可抵消仪器稳定性差，进样量不够准确等缘由带来的定量分析误差。

缺陷是样品配置比较费事，不易寻觅内标物 第八节 定性与定量分析〔二〕内标法1．任务曲线法 内标任务曲线法与外标法一样，只是在各种浓度的规范溶液中，参与一样量的内标物，进样分别丈量组分i与内标物s的峰面积A〔或峰高〕，以其峰面积比Ai/AS浓度为纵坐标，以对照品溶液的Ci〔规范〕绘制任务曲线，计算回归方程式及相关系数 Ci= b Ai /As + a 上式中，b：斜率与；a：截距；Ai：待测组分的峰面积或峰高； AS：内标物的峰面积或峰高 第八节 定性与定量分析 2．内标对比法〔内标一点法〕内标对比法这种方法不需知道校正因子又具有内标法的定量准确度与进样量无关的特点方法简便适用第八节 定性与定量分析 三、运用例如 高效液相色谱法主要用于复杂成分混合物的分别、定性与定量，其定性与定量方法与气相色谱一样HPLC已广泛运用于微量有机药物及中草药有效成分的分别、鉴定和含量测定近年来，对体液中原形药物及其代谢产物的分别分析，无论在灵敏度、专属性及快速性方面都有独特的优点，已成为体内药物分析，药物研讨及临床检验的重要手段。