仪器分析-高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量.docx

反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量前言：本次实验报告在前言中简单阐述 HPLC 基本原理，介绍 HPLC 仪器的结构特点和应用范围；研究对象的化学结构、理化常数和文献报道测定方法咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%—4.7%可乐、APC药片中均含有咖啡因其分子式为C8H10O2N4，结构式:CH3o nN — CH3NCH3一、仪器与试药高效液相色谱仪（日本岛津） 咖啡因对照品；甲醇为色谱纯；百事可乐（康师傅乌鲁木齐饮品有限责任公 司）；红牛（红牛维他命饮料有限公司）；叶尔羌茶（新疆叶尔羌茶有限责任公司） 二、方法与结果2.1色谱条件 色谱柱：C18 （4.6x150mm, 5Um）,流动相：甲醇水=30:70, 测定波长280nm,柱温30°C，流速：lml/min,进样量：10^L2.2系统适用性实验 取供试品20卩L进样，记录色谱图，咖啡因峰的保留 时间为4.253 min，各峰与相邻峰的分离度为，拖尾因子为 ，符合药典 规定,理论塔板数按咖啡因峰计算大于2 0 00 。

对照品及供试品的色谱图如下：⑴ 对照品的色谱图Detector A Ch1:280nm5550454035302520151040.011.0 2.0 3.0 4.05.0 6.0 7.08.0 9.0 min⑵ 供试品的色谱图2.3 溶液制备精密称取咖啡因对照品10mg，加甲醇定容至10ml吸取上述溶液0.5ml,加甲醇稀释到10ml，则溶液浓度为50卩g/ml供试品溶液：⑴百事可乐：取30ml的可乐放入烧杯中，用超声波脱气15min,驱赶饮料 中的二氧化碳，用移液管精密移取1 ml的可乐脱气饮料，用水稀释至10ml⑵红牛饮料：用移液管精密移取1 ml的红牛饮料，用水稀释至10ml⑶取一包叶尔羌红茶，取50ml沸水浸泡1小时，后取该溶液1ml,用水稀 释至25ml2.4 方法学考察2.4.1 线性范围考察分别量取贮备液5个以上浓度的样品，置于10ml容量瓶，稀释至刻度，得 到对应的浓度系列标准溶液取上述系列浓度溶液经0.22刚的微孔滤膜过滤， 进样，得系列浓度对应峰面积和保留时间以标准溶液的质量浓度（X）为横坐 标，色谱峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，其线性方程为：Y=a+BX （请将 下图中的线性方程在此写出） ，相关系数为 r= 0.9988 ，表明咖啡因在 0.4945-2.4725 浓度范围内线性关系良好。

表1 标准曲线编号12345浓度（单位）4.9459.8914.83519.7824.725峰面积1630892655243995225392606559832.4.2 加样回收率试验（仅设计实验内容）精密称量取9份已知含量的同批样品，分为3组，按低、中、高浓度分别加 入咖啡因对照品储备液，均定容到一定体积后，进样测定，计算加样回收率用 9 个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在l : 1左右，其他两个浓度分别约为供试品含量的80%和120%表2 回收率的实验结果编号 样品含量 加入量 实测值 回收率 平均回收 RSD%率123489103. 样品测定取分别取样品3份，按照供试品溶液制备方法操作后，HPLC测定，结果平均值为：264031 测定是峰面积，请代入标准曲线算出样品浓度4. 讨论⑴测得样品平均峰面积A=264031，回归曲线y=25471x+26818, r=0.9988,则得样品浓度C =9.3131卩g/ml，即本可乐的咖啡因含量:93.131卩g/ml.(样)(2) 标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。

标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件(检测器的响应性能，柱温，流 动相流速及组成，进样量，柱效等)很难完全相同，因此容易出现较大误差此 外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品(或已知准确含量的样 品)，而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差3) 高效液相常用的检测器有紫外检测器，荧光检测器，示差折光检测器，我们 试验中常常用紫外检测器4) 本次试验掌握了高效液相仪的操作，了解了其基本原理掌握了高效液相测 定样品做回归曲线但是由于时间有限，我们还是不能够很娴熟的操作，相信在 以后的锻炼中我们的试验素养会不断提高。