组织工程学天然高分子材料之胶原.ppt

组织工程学 —天然高分子材料胶原骨组织的等级结构 Hierarchical architechture of bone骨的等级结构（1）密质骨和松质骨；（2）密质骨骨单位和哈氏管，（ 3）骨层板和（4）胶原纤维 组成的胶原纤维束胶原纤维结构组成 胶原分子中间部分的氨基酸排列 （a）每个第三个氨基酸残基是甘 氨酸，X 和 Y通常是脯氨酸和羟脯氨酸残基，（b）甘氨酸是最小的 氨基酸，（c）三股螺旋使得甘氨酸残基指轴内，而另外两个残基处 于螺旋表面，（d）脯氨酸和羟脯氨酸的残基与多肽链结合，增强分 子的刚性疏松结缔组织成纤维细胞、 巨噬细胞 浆细胞、 肥大细胞 细胞：脂肪细胞 未分化的间充质细胞白细胞p组成： 胶原纤维纤维： 弹性纤维网状纤维蛋白多糖基质： 纤维粘连蛋白组织液Typical Extracellular matrix细胞外基质（extracellular matrix, ECM）pECM是细胞外大分子构成的网络包括：胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白等p结缔组织中含量较高p影响细胞的存活、死亡、增殖和分化Collagen 胶原p胶原是动物中的主要纤维蛋白，是所有多细胞动物，包括 海绵体、无脊椎动物和脊椎动物的细胞外基质的主要结构 成分。

p胶原原纤维占人和高等动物总蛋白量可高达30%，其作用 是保持组织完整以及提供每一个结缔组织所需要的特殊力 学性能p人体中有16％左右是蛋白质，胶原占体内蛋白质总量的 30－40％，主要存在于皮肤、肌肉、骨骼、牙齿内脏和 眼睛瞪部位p从生物医学角度，胶原在发育、伤口愈合、血小板活化和 血管生成中具有重要作用另外很多遗传病的起因也被证 明是由于胶原发生了突变，而胶原在其合成、降解或免疫 学方面的微小变化也可以引起许多疾病胶原的结构p胶原是一类由20种常见的氨基酸合成而来的蛋白质 ，但是它在氨基酸组成、重复的序列模式、高度的 翻译后修饰和特有的分子内交联上别具一格p天然的胶原蛋白是一个由3 3条具有左手条具有左手螺旋的链相 互缠绕形成右手超螺旋右手超螺旋的分子胶原的超螺旋结构 是靠链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其 稳定性的p原胶原：3条肽链形成的螺旋，含三种结构：螺旋 区、非螺旋区及球形结构域Structural features pAll collagen molecules are trimers consisting of three polypeptide chains, called  chains. pAlong at least part of their length, the three polypeptide chains of a collagen molecule are wound around each other to form a unique, rod-like triple helix.p 一个典型的胶原分子长300nm、直径为2.5nm。

在每一条左手螺旋的胶原链内，每一圈螺旋需要3 个氨基酸残基胶原螺旋的螺旋度不象-螺旋那 么高胶原螺旋的左手性，以及胶原的许多刚性 源于许多脯氨酸残基的立体限制胶原分子的末 端含有非螺旋部分，这一部分似乎对纤维形成过 程中胶原分子的正确排列以及交联是必需的p 典型的胶原螺旋在任一圈的第3个位置上都含有甘氨 酸残基胶原的特点是具有重复的-Gly-X-Y-序列，其 中X常常是脯氨酸，而Y是4-羟脯氨酸，它是脯氨酸的共 价修饰衍生物脯氨酸和4-羟脯氨酸的总和占胶原分子中 残基数的四分之一除了4-羟脯氨酸外，5-羟赖氨酸也 常出现在胶原分子中p 一条链上的每一组-Gly-X-Y-中的甘氨酸残基的酰 胺氢原子都能与一个相邻链上的残基X的羰基氧原子之间 形成分子内氢键脯氨酸和羟脯氨酸残基在胶原的结构中 起着至关重要的作用，这些残基的有限的构象松弛度不仅 可以防止-螺旋的形成，而且可以使得胶原螺旋和胶原纤 维本身显示出点刚性羟脯氨酸残基的羟基参与形成的氢 键将使胶原三股螺旋更稳定胶原分子中间部分的氨基酸排列 （a）每个第三个氨基酸残基是甘 氨酸，X 和 Y通常是脯氨酸和羟脯氨酸残基，（b）甘氨酸是最小的 氨基酸，（c）三股螺旋使得甘氨酸残基指轴内，而另外两个残基处 于螺旋表面，（d）脯氨酸和羟脯氨酸的残基与多肽链结合，增强分 子的刚性。

N-C-CO-H HH-N-C-CO-H2CCH2CH2H-N-C-CO-H2CCH2CHHOH甘氨酸Gly-脯氨酸Pro-羟脯氨酸Hyp-原胶原分子二级结构原胶原形成 胶原纤维胶原纤维电镜图胶原类型p在原纤维中发现了20种胶原，其中5种含量最丰 富的胶原类型是：nI 型胶原是骨、腱、角膜和韧带中的主要胶原 ，最高可达体内所有胶原的90%nII 型胶原在软骨、玻璃体和脊索中形成原纤维 nIII 型胶原与I 型胶原并存于结缔组织nV型和VI型为异三聚体，与其他三种胶原共存 于原纤维中 p由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、上皮细胞分泌在 RER上合成，形成三螺旋之前于Pro及Lys残基上进行羟基 化修饰p羟化反应由脯氨酰4羟化酶（P4H）、脯氨酰3羟化酶催化（P3H）pVc是酶的辅助因子，Vc缺乏导致坏血病p交联：由侧向相邻的lys或hyl残基氧化后所产生的两个醛基间进行缩合而成交联后后形成不溶性纤维，原胶原呈阶梯状排列，电镜下可见间隔67nm的横纹胶原的体内合成（翻译）Collagen fibril bundles: a branching assembly unit in tendon morphogenesisTEM image of collagen胶原的一般生化特性—变性p胶原变性是指三股螺旋之间的氢键断裂，螺旋解 开，形成单链无规则线团，因而发生性质的改变 （比如粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫 外吸收增加等）。

加热、改变胶原溶液的pH值或 受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等 ）等影响，均可使胶原变性p通常把50%胶原分子发生变形的温度称为变性温 度Td（denaturation temperature）由于这 一现象和结晶的熔解相类似，故又称为熔点或熔 解温度胶原的变性温度与羟脯氨酸的含量呈正 相关其它生化特性p天然胶原除非先经尿素处理使之变性，否则不易 溶于碱、弱酸及一般浓的中性盐类p等电点为pH7-7.8，在强碱下长时间浸渍，其等 电点会下降至pH4.7-5.3，并伴有溶解现象p胶原不溶于水，但可溶于热水膨润的胶原经加 热后，会产生不可逆收缩，加热至63-65℃时， 纤维长度变为原来的1/9，若再加热，三股螺旋 分开，发生热变性，形成明胶p未变性的胶原可被酸性红染成红色，变性者则否 胶原的提取--牛肌腱胶原的制备p将湿重100克牛肌腱洗净，0.5%Tris处理后取出肌腱进行 切片，用75%酒精溶液进行消毒处理，用灭菌蒸馏水冲洗 后用匀浆器匀浆， 再用灭菌蒸馏水洗涤p以5000r/min离心15分钟，收集沉淀再悬浮于生理盐水中 1小时以5000r/min离心15分钟，再将肌腱悬浮至于 1.5L含水果蛋白酶2mg的0.05mol/l的醋酸溶液中，在4℃ 下慢慢搅拌消化72小时。

以5000r/min离心15分种p将上清液用0.lmol/l的NaOH调节pH值至中性，加入NaCl 至最终浓度达2.5mol/L左右搅拌过夜，在中性条件下进 行盐沉淀p以5000r/min离心15分种沉淀即主要为1型胶原蛋白p将沉淀用冷的灭菌蒸馏水作短时间洗涤，然后溶解在0.05mol/l的醋酸溶液中，以0.05mol/l的醋酸溶液作透析 外液在10℃下透析2天，然后在PH 为7.4的含130mmol/l 的NaCl溶液中透析物理改性方法p通过物理手段对胶原蛋白改性有紫外线照射、重度脱水、 γ射线照射和热交联等方法p胶原溶液如被紫外线照射,将在分子间产生交联,粘度增加 ,生成凝胶目前常用的紫外线改性胶原膜的方法是将胶 原膜放在铝箔上,距离254 nm 紫外灯20 cm 高度,照射1 ～5 h 对经紫外线照射的胶原膜进行力学性能和胶原酶 试验表明:交联胶原膜的收缩温度Ts 和抗胶原酶解的能力 均显著高于未交联胶原膜p重度脱水也是胶原蛋白物理改性中常用的方法,该法是通 过脱水导致胶原分子间交联,从而增加变性温度,改善胶原 的性能p物理方法改性胶原蛋白的优点是可避免外源性有毒化学物 质进入胶原内,缺点是胶原交联度低,且难以获得均匀一致 的交联。

化学改性方法p主要是通过化学交联进行改性p交联剂按交联键发生的部位可分为两种:一种是分子内交 联,它是在同一个螺旋内两条肽链之间形成的交联键,这类 交联键主要影响交联产物的变性温度和拉伸强度等性能; 另一种是分子间交联,它是在两条相邻的螺旋间的肽链中 形成的交联键这类交联键主要影响交联产物的溶胀性和 表面延伸性当两条微纤维之间的距离小于交联剂分子的 长度时,交联也可以在两条相邻的微纤维之间发生p目前常用的化学交联剂有戊二醛、1 ,6 - 己二异氰酸酯( HDI) 、碳二亚胺( EDC) 、叠氮二苯基磷(DPPA) 、酰基 叠氮化物、聚环氧化物以及京尼平等p将制备的胶原膜或者海绵置于0.25% 戊二 醛溶液中预交联10 min 后，浸泡于含 0.25% 戊二醛的0.05 mol/L 醋酸溶液， 于4℃交联24 h，PBS 缓冲液漂洗3 次化学交联－戊二醛交联法p戊二醛是到目前为止应用最广泛的蛋白质交联剂,其水溶液在室 温下就能高效地与胶原缩氨酸链上的氨基反应,形成稳定交联p是一种同型双功能交联剂其两个醛基可分别与两个相同或不同 分子的伯氨基形成Schiff 碱, 将两个分子以五碳桥连接起来。

高浓度的GTA 与胶原分子赖氨酸或羟赖氨酸残基E2氨基反应, 形成分子间交联p戊二醛与蛋白质交联的特点是活性高、反应快、产物稳定、对沸 水、酸、酶的抵抗能力强,但有细胞毒性, 且其用量难以控制化学交联－EDC交联法p1一乙基一3-(3一二甲基氨基丙基)一碳化二亚 胺（EDC） 是化学性质极为活泼的化合物, 能 使氨基和羧基之间形成酰氨键, 其既可与羧基 结合, 也可与氨基结合, 通常羧基与EDC 反应 生成中间产物, 再与另一分子的氨基反应而形 成偶联物EDC反应的pH 为5～ 9, 一般胶原 交联选择pH7 左右, 4℃或室温24h化学交联－EDC交联法p将胶原海绵浸入50ml含50 mmol/L的2-(N-吗琳 )乙撑磺酸(MES)的体积分数为40%的乙醇溶液中 ，室温下浸泡30 minp加入 (EDC) 65 mg和N-基唬拍酞亚胺(NHS)15 mg，摇动使之溶解，室温下反应数小时p分别用无菌0.lmol/L Na2HP04, 1 mol/L NaCl 和蒸馏水冲洗胶原海绵，再次冷冻干燥应用胶原可以用于制造止血海绵、创伤辅料、人工 皮肤、手术缝合线、组织工程基质等胶原在应用 时必须交联，以控制其物理性质和生物可吸收性。

戊二醛和环氧化合物是常用的交联剂残留的戊二 醛会引起生理毒性反应，因此必须注意使交联反应 完全胶原交联以后，酶降解速度显著下降应用-作为药物和基因输送系统p缓释剂是指能够延缓药物释放、持续释药8小时以上的一 类制剂p胶原材料不仅生物相容性好，而且可通过降解机制控制药 物释放的速度，在生物材料领域有较多研究应用在药物 缓释剂中，胶原或变性胶原明胶主要被用作药物载体、赋 型剂或缓释壳层等，缓释系统的形式有多种，如膜、海绵 、片、微胶囊等p早在20世纪70年代，国外就有用无端肽再生胶原制成的 0.01一0.5mm膜，对吸收的药物可缓慢释放的报道随 后，又相继对胶原药物缓释体系进行了研究，胶原可吸收 性缓释药膜、伤口控释抗生素、缓释微胶囊已有报道应用—组织工程p胶原不仅可生。