CRISPR-Cas-----9.ppt

CRISPR-Cas 9 靶向基因操作技术名词解释n1 CRISPR：clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences 成簇的、规律间隔的短回文重复序列 n2 Cas ：CRISPR-associated CRISPR相关基因 n3 靶向：对特定目标(分子、细胞、个体等)采取的行动如外源基因在宿主细胞基因组DNA预期位置上的定向插入；药物分子对效应靶组织或细胞的定向传送或作用 CRISPR-Cas系统的发现1 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫 2 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的 CRISPR-Cas概述 CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术CRISPR-Cas概述nCRISPR-Cas主要由两部分组成识别识别切割切割CRISPR结构nCRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。

CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别Cas家族nCas（CRISPR associated）：n 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用Cas分类n因为Cas 基因多样性异常丰富，简单的分类很难区分那些同源但功能并不相关的Cas 蛋白30多个研究小组共同提议，考虑多个因素，包括保守性的Cas 蛋白之间的进化关系及Cas 基因操纵子的组成方式等，将CRISPR/Cas 的免疫机制分为相对独立的层次：n第一个层次主要是对外来信息的处理和加工，形成免疫记忆，也就是新的间隔序列的获得，主要由通用的核心蛋白Cas1 和Cas2 参与完成；n第二个层次主要为初级CRISPR RNA 成熟以及识别和降解入侵的外源遗传物质n按照该分类标准可以将CRISPR/Cas 系统分为：Type、Type、Type三种不同类型Cas 9nType系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9 蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA 或是外源质粒。

nCas9 蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc 核酸酶的活性，一个在中部有类似HNH 核酸酶的活性n嗜热性链球菌具有典型的Type CRISPR/Cas 系统，它的CRISPR/Cas 系统编码tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导RNase和Cas9 完成前体crRNA 的成熟随后tracrRNA 还能与成熟的crRNA 的重复序列配对形成RNA 二聚体，进而和Cas9 蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA 功能36CRISPR-Cas9原理n此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割n作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。

将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力应用 n基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上2 n2013 年 1 月份，美国两个实验室在Science杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。

在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法2 nCRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔技术优缺点n优点： 1、靶向精确性更高RNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配， Cas9才会对DNA进行剪切n 2、可实现对靶基因多个位点同时敲除n 3、实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本n 4、无物种限制n缺点： 该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究视频ncrispr cas 9 再见。