多酚氧化酶的分离纯化蛋白质含量活性测定及电泳.doc

多酚氧化酶的分离纯化、蛋白质含量、活性测定及电泳博哥（中山大学化学与化学工程学院，广州510275）摘要多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关本实验选取蘑菇、茄子、 马铃薯为实验材料，提取PPO的粗酶液，再通过考马斯亮兰法法测定蛋白质含量，并采用邻苯 二酚、L・多巴为底物，测定PPO活性，最后，进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，马铃薯 酶液中PPO含量最多为15766 jimol -L1,其次是蘑菇为13931 pmol ・L",茄子酶液PPO最少, 含虽为4061 pmol - L-1.但是，以邻苯二酚或多巴为底物时，茄子的比活力最高，蘑菇与马铃 薯酶液的比活力相近聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，茄子酶液中存在较多同工酶，蘑菇与马铃薯 则较少关键词多酚氧化酶考马斯亮兰法聚丙烯酰胺凝胶电泳1引言多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO, EC.1.10.3.1）是植物体内普遍存在的一类铜结合酶多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醍在广义上，多酚氧化酶 可分为三大类：单酚单氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase,EC」」4.1&1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶 catechol oxidsc,EC. 1.10.3.2）和漆0§（laccasc,EC. 1.10.3.1）。

在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酿主 要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶现在大部分文献所说的多 酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关因此，研究多酚氧化酶（酪 氨酸酶）的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生 黑色素引起的疾病（黄褐斑等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要的治疗意义本实验选取蘑菇、茄子、马铃薯为实验材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸 钱沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液再通过考马斯亮兰法法测定蛋片质含量，并采用邻苯 二酚、L•多巴为底物，测定PPO活性最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的带电性质, 以及2实验部分2.1材料与试剂新鲜蘑姑、茄子和马铃蒋购于市场;L・DOPA（L・3・（3,4•二疑苯基）丙氨酸、邻苯二酚、牛血清白 蛋白、硫酸钱、考马斯亮蓝G-250. Tris （瓮甲基氨基甲烷）、硫酸钱、氯化钠、0」mol/L磷酸 缓冲液pH 6.8(内含20 mmol/L抗坏血酸)、分离胶缓冲液(pH 8.9)、浓缩胶缓冲液(pH 6.7)、 30%丙烯酰胺、10%过硫酸钱、四甲基乙二胺(TEMED)、样品缓冲液、脱色液、Tris•廿氨酸电 泳缓冲液(pH 8.3)2.2实验器械与仪器设备试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液器、滴管等、试剂瓶、1.5 ml离心管、透析袋、过滤纱 布、植物组织匀浆器、pH计和pH试纸、低温离心机(徳国HETTICH公司、UV-1901紫外可 见光分光光度计(北京普析公司)、旋涡混合器、夹芯式垂直电泳槽、电泳仪、恒温水浴2.3实验方法2.3.1多酚氧化酶的分离纯化1. 粗酶提取：蘑菇、茄子、马铃薯50g按1： 2 (W/V)比例与冷的0.1 mol/L磷酸缓冲液 pH 6.8(内含20 mmol/L抗坏血酸)混合，植物组织匀浆器匀浆1・3分钟后，4层纱布过滤，滤液 以6500卬ni离心10 min,弃除沉淀获得酶提取液。

测量清液体积，留取lml用于后而测定蛋 白质浓度和活性2. 盐析：在酶提取液中加入固体硫酸钱使其达到65%饱和度(25° C时,100 ml应加43 g), 再以6000 rpm离心20 min,收集沉淀将沉淀溶解在10-20 ml缓冲液中，用10000 rpm再次离 心3-5 mine用于活性测定和电泳分析2.3.2考马斯亮兰法测定蛋白质含量1. 取1.5ml离心管16支，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给 各试管分别不同剂量，然后用无离子水补充到25 |ilo最后各试管中分别加入1.0 ml考马斯亮兰 G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合2. 加完试剂2〜5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的 光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即25W H2O加1.0 ml G-250试剂3. 用标准蛋白质量(gg)为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准 曲线由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量2.33 PPO活性测试采用邻苯二酚、L・多巴为底物，在含有0.94 ml pH 6.8的().1 mol/L磷酸钾缓冲液离心管中 加入10 ml酶液，再加入50 ml的0.025 mol/L邻苯二酚溶液;或者在含有0.82 ml pH6.8的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液离心管中加入100 ml酶液,再加入80 ml的0.025 mol/L邻苯二酚溶液，在紫外可见分光光度计475 nm处测时间扫描值。

0D值一般在0.01-0.4/min Z内，如果过大，请 减少酶液的用量或者将原酶液稀释后再测定每个样品至少测平行样三次通过0D值上升的 读数变化确定PPO的酶活大小2.3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 凝胶制备：脂蛋白电泳一般采用分离胶和浓缩胶组成的凝胶板；下层为分离胶，约含 7%丙烯酰胺；上层为样品胶，约含2.5%丙烯酰胺，制备方法按下述进行⑴分离胶制备：30%丙烯酰胺溶液5.0 ml；凝胶缓冲液2.5 ml；蒸憎水12.5 ml； TEMED 0.01 ink置小烧杯中，混匀，再加入10%过硫酸鞍溶液0.15 ml,混匀，迅速用滴管分装在二块 玻璃板之间，（玻片周围的空隙先用硅橡胶条封住，放入电泳装置中夹紧），凝胶加至红色背景 底线处），然后用注射器沿玻板壁小心地在胶面上滴加蒸憾水（约0.5 cm）,使凝胶形成时有一水 平面，在室温中放置30 min即可聚合完全2）浓缩胶制备：30%丙烯酰胺溶液1.0 ml,凝胶缓冲液1.25 ml,蒸馆水7.65 ml, TEMED 0.005ml,置小烧杯中，混匀，再加10%过硫酸镀溶液0.1 ml,混匀将分离胶上层的水倒去， 加入配制好的浓缩胶溶液，至红色背景上线处，插入加样梳，放45 min聚合后即可使用，使用 前小心拔去加样梳。

2. 加样：取实验一中制备的多酚氧化酶样品（蛋白浓度约mg/ml,含量高可稀释，含量低 可以多加上样量）30 用30卩】样品缓冲液混合，然后用微量进样器取此混合液10-50 |11加 于凝胶的每个凹槽中3. 电泳：在电泳装置的上、下槽中分别注入Tris■廿氨酸缓冲液，样品端接负极（短玻璃的 一边），电压控制以浓缩胶中100 V,分离胶中180 V电压进行电泳，至距底线1 cm时关闭电 源将电泳后的凝胶取岀，置于培养皿中，用蒸馆水冲去残留缓冲液4. 活性染色：电泳结束后，将其中的一块板至于培养皿中，加入邻苯二酚溶液，使胶完 全浸泡其中，由于酪氨酸酶可以催化邻苯二酚形成黑色的邻醍，可以显示出酪氨酸酶的电泳条 带，如果有多条，则说明存在着同工嗨5. 考马斯亮蓝染色：将活性染色后的凝胶加入染色液，使将凝胶完全浸泡其中，至凝胶 上色后倒岀染色液，用蒸憾水冲去残留染色液，加入脫色液，直至背景清晰透明，于凝胶分析仪上成像分析或照相3结果分析与讨论3.1数据处理与分析3.1.1考马斯亮兰法测定蛋白质含量测定表1标准1111线及样品数据记录序号浓度/ pniol • L'1Abs序号浓度/ pmol・L'1Abs样品浓度/ gmol • L'1Abs标样1100.000.044标样4600.000.516蘑菇278.620.218标样2200.000.155标样51000.000.757茄子81.220.062标样3400.000.335马铃薯315.320.247图1标准蛋白质Abs・浓度校正曲线样品测定时加了 5 ul稀释10倍后的样品溶液，然后再加入20 ul蒸饰水和1.0ml考马 斯亮蓝，据此对以计算各样品酶提取液的浓度：蘑菇：278.62 pmol ・L" X 10X 5=13931 pmol ・L“；茄子：81.22 ymol •L'1 X 10X5=4061 pmol ・L"； 马铃薯:：315.32 中nol ・ L1 X 10X 5=15766 pmol ・ L13.1.2 PPO活性测试PPO活性测试原始实验数据记录于表2,并计算比活力值，比活力=测得的每毫升酶催化活 力(OD/min)^每毫升中蛋白质的含量。

结果显示，以邻苯二酚或多巴为底物时，茄子的比活力 最高，蘑菇与马铃萼酶液的比活力相近表2 PPO活性测试数据以及比活力样品邻苯二酚/0D • min*1比活力（邻苯二酚） /0D • min'1 ・ pmol1多巴 /OD • min'1比活力(多巴) /OD • min'1 • pmol'1蘑菇0.0610.4380.0730.052茄子0.0952.3390.0480.118马铃薯0.0610.3870.087().0553.1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳图2考马斯亮蓝染色后多酚氧化酶电泳图表3电泳加样顺序1 2345678910标准蛋白蘑菇茄子马铃薯蘑菇茄子马铃薯蘑菇茄子标准蛋白从考马斯壳蓝染色后多酚氧化酶电泳图可以看出茄子的电泳带呈多条状，所以茄子酶液 中存在同工酶蘑菇与马铃薯的电泳带没有明显的多条状，所以不存在同工酶3・2讨论本次实验由多个同学分工完成，实验的效率较高，大大节省了实验时间以及实验器材但 是，山于不同同学的操作习惯不同，也会给实验结果造成一定误差，并且也给实验结果的汇总 造成一定困难本次实验结果的主要误差来源于，标准蛋白溶液配制的准确性，以及样品酶液 加样的准确性4结论以蘑菇、茄子.马铃薯为实验材料，提取PPO的粗酶液。

再通过考马斯亮兰法法测定酶液中蛋白质含量，结果显示，马铃薯酶液中PPO含量最多为15766 pmol -L1,其次是蘑菇为13931 bimol・L“，茄子酶液PPO最少，含量为4061 jimol ・L“但是，PPO活性测试结果显示，以邻 苯二酚或多巴为底物时，茄子的比活力最高，蘑姑与马铃黑酶液的比活力相近，具体数值见表 2最后，进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以看出茄子的电泳带呈多条状，所以茄子酶液中存 在较多同工酶，蘑菇与马铃薯的电泳带多条状不明显，存在较少或者不存在同工酶5感想与体会通过这次实验，学习和了解蛋白质提取、分离的基本原理和方法，掌握蛋白质含量测定方 法，以及多酚氧化酶活性测定方法，聚丙烯酰胺凝胶电泳原理和作用本次实验的步骤繁多， 知识量大，但以多酚氧化酶为线索很好的串联在一起，使整个实验显得冇条不紊先前通过闫老师的美白面膜实验，了解了酪氨酸酶在黑色素合成起了关键作用，通这次实 验，进一步加深了对酪氨酸酶的认识，了解到酪氨酸酶是单酚单氧化酶，并且认识到多酚氧化 酶与植物组织培养的酿促褐变以及果蔬品质密切相关参考文献1.化学生物学讲义■实验1多酚氧化酶的分离纯化、蛋白质含量测定 2.化学生物学讲义■实验4多酚氧化酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳。