内嗅皮层微注射Orexin-A对大鼠睡眠-觉醒及空间记忆的影响.docx

内嗅皮层微注射Orexin-A对大鼠睡眠-觉醒及空间记忆的影响齐爱萍，何 超，夏建霞，张 丹，陈芳，阎洁，胡志安（400038重庆，第三军医大学基础部生理教研室， 重庆市神经科学研究所）［摘要］目的 探讨内嗅皮层注射orexinA对Sprague-dawley （SD）大鼠睡眠■觉醒周期以及对空间记忆的影响 方法 选用健康成年雄性SD大鼠45只，体质量250〜300 g,采用同步记录大鼠脑电和肌电活动，观察rexinA及 SB-334867内侧内嗅皮层微注射后大鼠睡眠■觉醒周期变化采用T-迷宫交替选择次数，观察SB-334867内侧内嗅皮 层微注射后大鼠T-迷宫选择正确率的变化结果 以人工脑脊液（ACSF）,二甲亚飒（DMSO）自身对照相比，分别 给予大鼠内侧内嗅皮层双侧微注射0.5U1后3h （11： 00〜12： 00、12： 00〜13： 00、13： 00〜14： 00）觉醒周期时 间无影响（P>0.05）,给药后24 h觉醒周期时间也无显著差异（P〉0.05）微量注射药物后，orexin.A（0.1 nmol/0.5 u 1）及SB-733467（6 mmol/0.5 u 1）在11： 00〜14： 00 3 h内对觉醒时间、NREM时间及REM时间均无影响（P>0.05）, 即对3h内（11： 00〜14： 00）大鼠总睡眠觉醒时间无显著性差异（P>0.05）。

以DMSO组间对照和orexinl受体阻 断剂SB-334867给药后的大鼠内侧内嗅皮层双侧微注射0.5 pl后，T-迷宫交替选择正确次数明显减少，正确率下降， 有显著性差异（P<0.001）结论内侧内嗅皮层orexin系统的支配可能参与了空间记忆，而不参与睡眠■觉醒周期调 节［关键词］orexin-A；内侧内嗅皮层；空间记忆；［中图法分类号］［文献标志码］AEffect of orexin-A injected into medial entorhinal cortex of rats on sleep-wakefulness and spatial memoryQi Aiping, He Chao, Xia Jianxia, Zhang Dan, YanJie, Hu Zhian （Department of Physiology, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China）［Abstract］ Objective To study the effect of orexin-A injected into medial entorhinal cortex （MEC） of rats on sleep-wake cycle and spatial memory of SD rats. Methods Forty-five healthy adult male SD rats, weighing 250~300g, were included in this study. Their cerebral and myoelectrical activities were synchronically recorded, their sleep-wake cycle and accuracy rate of alternative selection in T-maze were observed after injection of orexin-A and SB-334867. Results Oexin-A and SB-334867 showed no significant effect on sleep-wake cycle, NREM and REM sleep time of rats 3 h after they were injected into MEC of rats compared with that of ACSF and DMSO （P>0.05）・ However, the accuracy rate of alternative selection in T-maze was significantly lower after injection of SB-733467 than after injection of DMSO （FvO.OOl） . Conclusion The orexin system in MEC may be involved in spatial memory but not in sleep-wake cycle.［Key words］ orexin-A； medial entorhinal cortex； spatial memorySupported by the National Natural Science Foundation of China （ ） .Corresponding author： Zhian Hu, Tel： 86-23-, E-mail：［基金项目］国家自然科学基金（）［通信作者］胡志安,：（023）； E-mail：Orexin是外侧下丘脑Orexin神经元产生的神经 肽，有两个单体：Orexin-A和Orexin-Bo大量文献 报道，Orexin系统通过兴奋皮层下促觉醒的核团启 动和维持脑觉醒的过程H⑵。

新近报道Orexin系统 还可支配认知功能相关脑区，包括前额叶皮层、隔 海马区、基底前脑和海马，进而参与空间学习记忆 等认知过程⑶内嗅皮层(entorhinalcortex, EC) 在海马和联合皮层的双向信息交流中起着接替站的 作用EC浅层主要神经元接受新皮层的输入，投 射至海马深层主要接受海马(cornu ammonis area 1, CA1)和下托的输入，将其传回至新皮层EC可分为 外侧内嗅皮层(lateral entorhinal cortex, LEC)和内侧 内嗅皮层(medial entorhinal cortex, MEC)目前认为 MEC主要参与传递和处理空间信息，在空间学习记忆 功能中具有重要的意义［4句本实验室前期研究显示MEC浅层的主要神经元 表达 Orexin 受体(Orexin receptors, OXR) --OX1R 和OX2R离体膜片钳实验证实Orexin-A能够通过0X1R兴奋MEC主要神经元，增强其突触传递 然而，Orexin-A在MEC对大鼠行为功能的影响还 不清楚因此，本研究首先采用脑电肌电记录方法, 观测了外源性给予Orexin.A以及0X1受体阻断剂 对睡眠-觉醒周期的影响；随后采用T.迷宫模型，检 测了 Orexin-A对空间学习记忆的影响。

1材料与方法1.1实验动物成年雄性SD大鼠45只，体质量250〜300 g,由第三军 医大学实验室动物中心提供分为2大组：睡眠.觉醒（两 组对照组与给药组共24只）,空间记忆（对照组与给药组共 21只）动物分笼饲养，12h/12h明暗周期，动物自由获取 水和食物1.2试剂人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid, ACSF, mmol/L ） : NaCl 124, KC1 3, CaCh2, MgCh2, NaH2PO4 1.23, NaHCOs 26, D-glucose 10o DMSO 由上海西宝生物科 技有限公司提供orexinA：溶于ACSF, SB-334867：溶于 DMSO均由美国Sigma公司提供1.3方法大鼠头部电极，套管埋置手术 经戊巴比妥钠（50 ml/kg）腹腔麻醉SD大鼠，固定于立体定位仪上，手术区皮 肤消毒，暴露颅骨，按照Paxinos和Watson的大鼠脑立体定 位图谱，在内嗅皮层（前囱后8.4 mm,中线旁左右旁开4.4 mm,深度5.2 mm）处埋置药物注射套管分别于冠状缝前 2 mm和人字缝前1 mm,右侧4 mm安置脑电电极;与双侧 颈肌内分别插入肌电电极记录肌电图（EMG） 1虬 将暴露的 脑电电极，肌电电极，套管及固定螺丝均用牙科粉固定于颅 骨上。

术后腹腔注射抗生素，恢复7〜10d微注射模式 在每只大鼠内侧内嗅皮层双侧微注射 orexinA 0.1 nmol/0.5pl （orexinl 受体阻断剂 SB・334867 6 mmol/0.5 gl）, ACSF （DMSO）为自身对照，经多导睡眠系 统记录24 h并进行分析分别每6只大鼠常规睡眠记录24 h 后，给予ACSF, DMSO （0.5 ^1）,记录24h48 h后再给予 orexinA, SB-334867o平均每天在10： 30〜11： 00进行微量注 射，注射速度0.5 ^il/min,注射完成后11： 00开始记录，用 SleepSigh软件记录脑电，肌电数据（脑电，肌电）分析 记录结束后，运用SleepSigh 分析软件进行结果数据分析处理EEG/ EMG信号经放大，过 滤（EEG 0.5-30 Hz； EMG 20-200 Hz）,再用分析软件 SleepSigh 以128 Hz扫描速度进行数字化，记录以10s为一个分析阶段 时间，睡觉-觉醒周期：觉醒期（wake, W）：脑电出现低振幅 高频率，波形不规则；肌电波动明显非快速眼动（non-rapid eye movement, NREM）睡眠：脑电振幅较高，频率低，较规 则（大脑皮质出现同步化高幅低频脑电波）；肌电平稳，波动 明显减少。

快速眼动（rapid eye movement, REM）睡眠：低振 幅快波为主要特征，无明显的肌电波动⑹1.3.4 T.迷宫训练SD成年雄性大鼠进行mEC区导管埋植手术，术后恢复7 d进行T迷宫适应4 d,在适应期限制其摄食 使体质量保持在实验前80%〜90%第12天开始正式的训练， 2次/d,首次选择臂均放食物（约为45 mg）在随后的11次选 择中，动物必须交替选择才能得到食物的奖赏若选择错误则 得不到食物奖赏，直到其选择正确为止训练达标的动物在间 隔24 h后给药测试微量注射给药剂量为：SB-334867 （6 mmol/0.5gl）； DMSO （0.5gl）o 给药 15 min 后进行 T-迷宫测试 也核团定位经戊巴比妥钠（65ml/kg）腹腔麻醉大鼠灌注断头取脑经冷冻切片（冠状切片30 pn厚）,HE染色定位 染色定位证实所有的微注射位点位于内侧内嗅皮层图1显示 了每只大鼠药物注射位点，清楚可见在内侧内嗅皮层区A：脑图谱示意图；B： HE染色鉴定药物注射部位（内嗅皮层）图1内嗅皮层核团注射部位鉴定1.4统计学分析数据以元±s表示，采用SPSS 13.0统计软件行1检验2结果2. 1微注射orex i n-A对睡眠-觉醒周期的影响与ACSF, DMSO自身对照相比，分别在给大鼠内侧 内嗅皮层双侧微注射0.5pil后3h 11： 00〜12： 00、12： 00〜 13： 00、13： 00〜14： 00觉醒周期时间无影响（P>0.05）, 给药后24 h觉醒周期时间也无显著差异（P>0.05）。

微量 注射药物后，orexin-A 及 SB-733467 在 11： 00〜14： 00 3 h 内对觉醒时间无影响（P>0.05）,在11： 00—14： 00 3 h内 NREM 时间无影响（P>0.05）,在 11： 00〜14： 00 3 h 后 REM 也无影响（P>0.05）,即对3h内（11： 00〜14： 00）大鼠总 睡眠觉醒时间无显著性差异（P>0.05）o见图2、38:0012:0016:。