实验一 糖类的颜色反应.doc

第十六章 实验技术实验一 糖类的颜色反应一、实验目的1．了解糖类某些颜色反应的原理2．学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法二、实验原理1.α-萘酚反应（Molisch 反应）原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与 α-萘酚生成紫红色物质因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应2.间苯二酚反应（Seliwanoff 反应）原理在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质此反应是酮糖的特异反应醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应三、器材1.试管及试管架 2.滴管3.水浴锅四、试剂1.莫氏（Molisch）试剂： 5% α-萘酚的酒精溶液，称取 α-萘酚 5g，溶于 95%酒精中，并用此酒精使总体积达 100mL，贮于棕色瓶内此试剂需新鲜配制2.塞氏（Seliwanoff）试剂：称取间苯二酚 0.05g 溶于 30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至 100 mL，此试剂需新鲜配制3.1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中。

4.1%果糖溶液：称取果糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中5.1%蔗糖溶液：称取蔗糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中6.1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉 1g 与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至 100mL7.0.1%糠醛溶液：称取糠醛 0.1g，溶于 100mL 蒸馏水中8.浓硫酸 500mL五、操作1.α-萘酚反应（Molisch 反应）取 5 支试管，分别加入 1%葡萄糖溶液、 1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、0.1%糠醛溶液各 1.5mL再向 5 支试管中各加入 2 滴莫氏试剂，充分混合斜执试管，沿管壁慢慢加入浓硫酸约 1mL，慢慢立起试管，切勿摇动浓硫酸在试液下形成两层在二液分界处有紫红色环出现观察、记录各管颜色试剂 现象 解释现象1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%淀粉溶液0.1%糠醛溶液2.间苯二酚反应（Seliwanoff 反应）取 3 支试管，分别加入 1%葡萄糖溶液、 1%果糖溶液、1%蔗糖溶液各 5mL再向各管分别加入塞氏试剂 2mL，混匀将 3 支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜色的变化及变化时间。

六、思考题1．可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？2．α- 萘酚反应的原理是什么？实验二 糖类的还原作用一、实验目的学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理二、实验原理许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，故在碱性溶液中能将铜、铋、汞、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定本实验进行糖类的还原作用所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂它们都是含Cu2+的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色或黄色的 Cu2O 沉淀生成 Cu2O 沉淀的颜色之所以不同是由于在不同条件下产生的沉淀颗粒大小不同引起的，颗粒越小呈黄色，越大则呈红色如有保护性胶体存在时，常生成黄色沉淀三、器材1．试管及试管架2．竹试管夹3．水浴锅4．电炉四、试剂1．斐林（Fehling）试剂菲林甲液（硫酸酮溶液）：称取 34.5g 硫酸铜（CuSO 4·5H2O）溶于 500mL 蒸馏水中菲林乙液（碱性酒石酸盐溶液）：称取 125g 氢氧化钠和 137g 洒石酸钾钠溶于 500 mL 蒸馏水中为了避免变质，甲、乙二液分开保存用前，将甲、乙二液等量混合即可。

2．本尼迪克特（Benedict）试剂称取柠檬酸钠 173g 及碳酸钠（Na 2CO3·H2O）100 g 加入 600mL 蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释至 850mL另称取 17.3g 硫酸铜溶解于 100 mL 热蒸馏水中，冷却，稀释至 150mL最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用3．1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中4．1%果糖溶液：称取果糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中5．1%蔗糖溶液：称取蔗糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中6．1%麦芽糖溶液：称取麦芽糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中7．1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉 1g 与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至 100mL五、操作先取 1 支试管加入斐林试剂约 1mL，再加入 4 mL 蒸馏水，加热煮沸，如有沉淀生成，说明此试剂已不能使用经检验，试剂合格后，再进行下述实验取 5 支试管，分别加入菲林甲、乙液各 1 mL，再向各试管分别加入 1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％麦芽糖溶液、1％淀粉溶液各 1mL。

置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却观察各管溶液的变化另取 6 支试管，用本尼迪克特试剂（每管加 2mL）重复上述实验比较两种方法的结果斐林氏与本尼迪克特试法：1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%麦芽糖溶液1%淀粉溶液斐林氏试剂本尼迪克试剂试解释以上表格现象：六、思考题1．斐林氏、本尼迪克特试剂法检验糖的原理是什么？2．你熟悉的糖中那些具有还原性？实验三 蛋白质的颜色反应一、实验目的熟悉一些常见蛋白质的颜色反应二、实验原理蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质颜色反溶液现象试剂应是一些常用的蛋白质定量测定的依据重要的颜色反应有：1.双缩脲反应将尿素加热到 180℃，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在 540nm 处比色，定量测定蛋白质。

CONH2NH2CONH2NH2 CONH2NHCNH2ONH3+ +CONH2NHCNH2O CNHO-HNCNHOCuHNCONHCHNO- 2-Cu2+OH-150℃紫 红 色 化 合 物2.蛋白质的黄色反应黄色反应是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色 OHHNO3+ OHNO2+H2O（ 黄 色 ）OHNO2+NaOHNOHO硝 醌 酸 （ 橘 黄 色 ）3.米伦氏反应米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应 HOOHNOHONOH2O++HONOONOH（ 亚 硝 基 ）汞 盐 红 色（ 邻 醌 肟 ）4.茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物此反应为一切氨基酸及 α-氨基酸所共有含有氨基的其他物质亦呈此反应CCOOHRCHOHN2CCOOHRCHOCO2NH3++++C9O3H6C9O3H4NH3 CCOONCHOOH2O+++茚 三 酮 还 原 茚 三 酮蓝 色 缩 合 物还 原 茚 三 酮三、器材试管和试管架、滴管、水浴锅、酒精灯或电炉、量筒、滤纸片、烘箱、白明胶。

四、试剂1. 卵清蛋白液：将鸡( 鸭)蛋白用蒸馏水稀释 20～40 倍，2～3 层纱布过滤，滤液冷藏备用2. 0.5%苯酚溶液：苯酚 0.5mL，加蒸馏水稀释至 100mL3. 1%白明胶液：1g 白明胶溶于少量热水，完全溶解后，稀释至 100mL4. 米伦(Millon)试剂：40g 汞溶于 60mL 浓硝酸(比重 1.42)，水浴加温助溶，溶解后加2 倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用此试剂可长期保存5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于 95%乙醇并稀释至 100mL6.浓硝酸：比重 1.427. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜 1g 溶于蒸馏水中，稀释至 100mL8. 尿素：如颗粒较粗，最好研磨成粉末状9. 10%氢氧化钠溶液：氢氧化难 10g 溶于蒸馏水，稀释至 100mL五、操作方法1.双缩脲反应①取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却然后加 10%NaOH 溶液 1mL 混匀，观察有无紫色出现②另取一试管，加蛋白质溶液 10 滴，再加 10% NaOH 溶液 10 滴及 1%CuSO4 溶液 4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

注意事项：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的 Cu(OH)2此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子 Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察2.蛋白质的黄色反应在一试管内，加蛋白质溶液 10 滴及浓硝酸 3～4 滴，加热，冷却后再加 10%NaOH 溶液 5 滴，观察颜色反应3.米伦氏反应① 用苯酚做实验：取 0.5%苯酚溶液 1mL 于试管中，加米伦试剂约 0.5mL(米伦试剂含有硝酸，如加入量过多，能使蛋白质呈黄色，加入量不超过试液体积的 1/5～1/4)，小心加热，溶液即出现玫瑰红色② 用蛋白质溶液做实验：取 2mL 蛋白质溶液，加 0.5mL 米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀( 因试剂含汞盐及硝酸之故 )，小心加热，凝固之蛋白质出现红色注意事项：蛋白质溶液中如含有大量无机盐，可与汞产生沉淀从而丧失试剂的作用，如此试剂不能测定尿中的蛋白质另外试液中还不能含有 H2O2、醇或碱，因它们能使试剂中的汞变成氧化汞沉淀遇碱必须先中和，但不能用盐酸中和4.茚三酮反应取 1mL 蛋白质溶液置于试管中，加 2 滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现(注意：此反应必须在 pH5～7 进行 )。

六、思考题1. 氨基酸与蛋白质具有哪些共同的颜色反应？说明原因2. 蛋白质除了可以实验中的这些颜色反应外，你还知道哪些蛋白质的颜色反应？实验四 蛋白质的沉淀反应一、实验目的加深对蛋白质的沉淀反应的认识，理解蛋白质沉淀反应的原理二、实验原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH 3+，—COO-，—SH，—CONH 2 等，和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层) 水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1. 加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。

盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若。