3、蛋白质的性质实验.docx

三、蛋白质的性质实验 （二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一．蛋白质等电点的测定1、目的1）．了解蛋白质的两性解离性质2）．学习测定蛋白质等点电的一种方法2、原理蛋白质是两性电解质在蛋白质溶液中存在下列平衡C4XJIIffiX f tftH fpHApI pH=p! pE-KpE崛*中I iEEiJtl艮 卜釀承 客常即国蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响当溶液的 pH 达到一定数值时，蛋白质 既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的 pH 值称为此种蛋白质的等电点不同蛋白质各有 其特异的等电点在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白 质的等电点最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值本实验借观察在不同 pH 溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混 合在酪蛋白溶液中）配置成各种不同 pH 值的缓冲液向各缓冲溶液加入酪蛋白后，沉淀出现最多 的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点3、器材水浴锅、温度计、200ml的锥形瓶、100ml的容量瓶、乳钵、试管、试管架及吸管4、试剂1） 、0.4%酪蛋白： 总量200ml （每组配100ml）称取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200ml锥形瓶内， 用少量40〜50°C的温水洗涤乳钵，将洗涤液液移入锥形瓶内。

加入10ml 1mol/L醋酸钠溶液把锥 形瓶放到50C水浴中，并小心的旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止将锥形瓶内的溶液全部移 至 100ml 容量瓶内，加水至刻度，塞紧瓶塞，混匀2） 、1.00mol/L醋酸溶液：每组配100ml3） 、0.10mol/L醋酸溶液：每组配200ml4） 、0.01mol/L醋酸溶液：每组配50ml5 、操作1）、取同样规格的试管 4 支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀试管号蒸馏水（ml）0.01mol/ml 醋酸(ml)0.1mol/ml 醋酸(ml)1.0mol/ml 醋酸(ml)1&40.62&70.33&01.047.41.62）、向以上试管中加含酪蛋白的醋酸钠溶液1ml，加一管，摇一管此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5观察其混浊度静置10分钟，再观察其混浊度最混浊的一管的pH即 为酪蛋白的电点二、蛋白质的沉淀及变性1 、目的1 ）．加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识2） ．了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义3） ．了解蛋白质变性与沉淀的关系2、原理原理： 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类1） 可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋 白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性如大多数蛋白质的盐析作用或 在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质提纯蛋白质时，常利用此反应2） 不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶 于原来溶剂中加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与金属离子或某些有机酸的反应都属于此类蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出因此变性蛋白 质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质液未必都变性3、 试剂配制1） 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1 : 9）总量500ml取100ml新鲜的鸡蛋清，加900ml水，搅拌均匀，澄清取上清液2） PH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲液：总量100ml3） 3%硝酸银溶液：总量10ml4） 5%三氯乙酸：每组配 50ml5） 95%乙醇：总量 250ml6） 硫酸铵结晶粉末：7） 饱和硫酸铵溶液：每组配 250ml8） O.lmol/LHCl:总量 300ml9） O.lmol/LNaOH：总量 100ml10） 0.05mol/LNa2C03溶液：每组配 100ml11） 0.1mol/l 醋酸溶液 100ml12） 甲基红溶液：总量200ml （每组配50ml）称取0.02g甲基红，溶于3.72 ml 0.02 mol/LNaOH溶液中，用水稀释至50ml。

13） 2%氯化钡溶液4、 操作（1）蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质盐的浓度不同， 析出的蛋白质也不同如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程加5%卵清蛋白溶液5ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋 白的沉淀倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内内容物过滤，向滤液中添 加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解2）重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物取1支试管，加入蛋白质溶液2ml,再加入3%硝酸银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生放置 片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？（3） 某些有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2ml，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成 放置片刻，倾出上清，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解4） 有机溶剂沉淀蛋白质取1支试管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇。

混匀，观察沉淀的生成5）乙醇引起的变性与沉淀取3支试管，编号依下表顺序加入试剂：此试验与等电点有关试剂d）管号5%卵清 蛋白溶液0.1%/L氢氧化钠溶液0.1%/L 盐酸溶液pH4.7缓冲 溶液95%乙醇 溶液11————1(pI)1211(>pI)————131——1( pl） —中性盐中和产生变性，形成沉淀一加盐酸后，变性但不析出；C, 无沉淀（pH < pl） —中性盐中和产生变性，形成沉淀一加盐酸后，变性但不析出. 但试验结果因试剂和操作手法、试管等会产生偏差（多次反复才能得到正确的结果）。

有机溶剂沉淀的影响因素① 温度： 多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降值得注意的是大 多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有 机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行， 加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高② 样品浓度：样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用 比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释 变性但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果反之，对于高 浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降通 常，使用5mg/mL〜20mg/mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果③ pH值：有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品 溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力④ 离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。

以蛋白质为例，盐浓度太大 或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过 5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水 溶液的2倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质 在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时先要选择合 适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH值和离子强度，使之达到最佳的分离效果沉 淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶 剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。