《转基因动物》课件.ppt

Transgenic Animals,,Baiyan Wu,Department of Medical Genetics Peking University,80年代以来，分子生物学和哺乳动物胚胎工程学的迅速发展以及两个学科的互相渗透和联系，使基因可以在实验室条件下，从一个动物体内分离出来，进行增值修饰，再引入同种或异种动物胚胎中，并在个体发育中得到表达，形成转基因动物(Transgenic Animals) 转基因动物的产生实现了人们构建具有目的性状的动物的意愿一、转基因动物的概念,转基因动物（transgenic animal）:基因组中整合的外源基因能够表达的一类动物称为转基因动物 转基因首建者(transgenic founder):经过遗传操作的胚胎发育而来的基因组上整合有外源基因的动物 嵌合体动物(chimera animal):只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物称为嵌合体动物二、转基因动物的研究概况,1949年Hammond报道了卵子在体外培养的方法.引发了一系列的胚胎体外操作实验—胚胎工程学. 1966年，Lin首次报道了显微注射方法.15年后才得到第一个转基因小鼠. 1977年，Gurdon在用mRNA和DNA注射爪蟾卵的实验中观察到转移的核酸能发生作用。

1980年，Brinster等用小鼠受精卵作了类似的实验.,1980年，Gordon 将SV40以及HSV的TK基因整合后的质粒，用显微注射法注入小鼠受精卵的雄原核内，首次成功地获得了转基因小鼠 1981年Constantini和 Wagner分别将家兔的-珠蛋白基因和人类 -珠蛋白基因与疱疹病毒胸苷酸融合基因注射到小鼠受精卵的雄原核内，成功地获得了转基因小鼠1982年，Palmiter等将小鼠金属巯蛋白(MT)基因启动子片段和大鼠的生长激素（GH）基因的融合基因注入小鼠受精卵雄原核内，获得了超级小鼠“supermouse”,,Brinster's growth hormone mouse,1985年Wagner等第一次使用逆转录病毒载体MMCV-neo感染ES细胞，用G418筛选转化细胞,制成嵌合体，以neo基因为探针检测，各分化组织中均有neo基因的表达 1986年，Robertson等用MPSVmos neo逆转录病毒载体转化ES细胞，首次通过ES 细胞途径获得转基因动物1987年，Thomas和Sapecchi等首次利用可以正负选择的靶载体，通过同源重组，造成了内源Hprt-基因的突变，获得了内源Hprt-的突变转基因小鼠，并确定了进行定位整合使用靶载体的基本原则。

1990年，Pursel获得转小鼠乳清酸性蛋白(whey acidic protein,WAP）基因猪，基因在乳中表达了WAP1992年Swanson等将-1球蛋白和 -球蛋基因导入山羊受精卵，得到转基因山羊中检测到人的血红蛋白 1993年，爱丁堡药用蛋白质有限公司报道了将抗胰蛋白酶基因注入羊受精卵，得到具有胰蛋白酶的羊，可提取胰蛋白酶用于肺气肿的治疗 同年，荷兰报道了将乳铁蛋白基因注入牛受精卵，得到的F1海尔曼公牛具有该基因，F2奶牛的奶中也含有这种蛋白可用于治疗人类免疫衰退性疾病近年来通过转基因奶山羊，得到高产量生产抗α-肿瘤坏死因子的抗体，用于风湿性和类风湿性关节炎的根治 2002年，Masaru Okabe 实验室成功建立了第一个应用RNAi的转基因小鼠这种转基因小鼠体内能产生特异针对GFP的siRNA，可以在GFP转基因小鼠全身各个组织内敲低GFP的表达三、转基因动物的原理及应用,（一）转基因动物的基本原理 （二）转基因动物技术的应用,（一）转基因动物的基本原理：,目的基因（或基因组片段）,↓ 显微注射等方法,受精卵或着床前胚胎细胞,↓ 移植,受体动物的输卵管（或子宫）,↓ 发育,分析转基因和动物表型的关系确定外源基因的功能,转基因动物（携带有外源基因）,培育品种优良的工程动物,,,,,,,,（二）转基因动物技术的应用,1、研究基因的结构和功能 2、研究发育过程中基因的特异性表达 3、遗传性疾病的研究 4、培育动物新品种 5、构建转基因动物—生物反应器,1、研究基因的结构和功能,1）组织特异性基因的表达。

2）通过研究转入外源基因后的新表型，发现 基因的新功能 3）发现新的基因导入外源基因后，由于基 因的随机插入，可能会导致内源基因的突 变，对这些突变进行表型分 析 4) 建立研究外源基因表达、调控的动物模型2.研究发育过程中基因的特异性表达,外源基因或基因的调控元件进入动物体内后，对基因表达的时空特异性研究 研究只能在胚胎期才表达的基因的结构和功能将不同外源基因转入宿主受精卵或早期胚胎干细胞，可观察目的基因在胚胎不同发育阶段的特异表达、关闭及调控机理3、遗传性疾病的研究,1）致病基因的研究 将致病基因或病毒基因导入动物，可研究 外源基因在宿主动物引起的病理变化，探讨发 病机理 2）建立遗传性疾病的转基因动物模型 这被认为是遗传学研究中继连锁分析、体 细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术 镰状细胞贫血、地中海贫血、高血压等 3）探讨生殖细胞的基因治疗方法HBV转基因小鼠：对HBV基因在不同组织中表达及其表达产物的生物学效应分析，研究HBV在人体内的生活史和致病机理，进行乙肝药物的筛选 侏儒小鼠 (dwarflit mice)：人生长激素缺陷I型模型，由生长激素等位基因隐性突变引起。

高血压动物模型 转基因猴“安迪”：导入了海蜇绿色荧光蛋白基因2001 The first pet was cloned. The kitten was named CC. Cats have a feline AIDS that is a good model for studying human AIDS,Phenotype of Ets2 transgenic mice,A progeroid syndrome in mice is caused by defects in A-type lamins,Nature ,Vol 423, 2003,a,b,c,d,het,hom,WT,heart,2 mm,myocytes,a,b,c,d,show smaller myocytes,WT,Mutant,a,e,h,g,f,WT,Mutant,Mouse Models of Obesity,已建立的遗传病转基因动物模型,疾病名称 转移基因 家族性淀粉状蛋白多发神经病变 突变人fransthyretin Lesch-Nyhan综合征 突变HPRT Down’s综合征 CuZn-SOD Alzheimer’s 病 淀粉样蛋白 骨生成不完全 突变（1）胶原蛋白前体 -1抗胰蛋白酶缺陷（肺气肿） 突变人PiZ 1-抗胰酶 原发性高血压 小鼠Ren-2肾素基因 糖尿病I型 H-ras临基因；MHCI类抗原H- 2kb 大鼠胰岛素II类抗原I-A,I-E 小鼠MHCI类抗原H-2kb 糖尿病II型 胰岛淀粉样多肽 镰状细胞贫血 人 和8globin； 人2珠蛋白和8Antilles 人2珠蛋白和8 基因 人2和8珠蛋白基因 -地中海贫血 人8基因,,,,,4、培育动物新品种,用转基因技术，把目的基因导入宿主动物，使转基因动物具有抗病、快速增长或增产某些特种蛋白等优良品质。

例:转生长激素基因猪5.构建转基因动物—生物 反应器（Bioreactor),用转基因动物—生物反应器生产基因药物（肽类药物） 荷兰的生物医药公司用转基因牛生产乳铁蛋白；英国的罗斯林研究所研究成功的转基因羊，其乳汁中含有-抗胰蛋白酶,可治疗肺气肿 目前国际上利用转基因技术已能生产许多贵重药用蛋白anti-thrombin III (to treat intravascular coagulation) 抗凝血酶III human blood clotting factors (VIII and IX)人凝血因子 human interleukin-2 collagen (to treat burns and bone fractures) 胶原质 fibrinogen (used for burns and after surgery), 纤维蛋白原 human fertility hormones, 生长激素 human hemoglobin, 血色素 human serum albumin (for surgery, trauma, and burns),人血清白蛋白 lactoferrin (found in mother milk),乳铁蛋白 tissue plasminogen activator, particular monoclonal antibodies (including one that is effective against a particular colon cancer),6、应用于人异种器官移植,通过转基因技术，克隆受体的补体调节蛋白基因，将这种基因转移到供体动物的基因组中，并在心血管内皮表达，避免受体的排斥反应。

1993年英国培育了37头含有人体基因的猪，临床试验具有安全性 1999年，陈实将带有人类基因的猪心，移植到猕猴体内，也度过了排斥反应四、转基因动物的构建方法,（一）转基因技术 （二）转基因动物的构建方法,（一）转基因技术,基因转移是指将目的基因导入到受体细胞的过程，它包括三方面的内容：目的基因、转化方法，受体细胞 根据不同的受体细胞选择不同的转化方法最原始的受体细胞是大肠杆菌,它作为受体细胞有以下优点： (1)生长迅速 (2)容易操作 (3)大规模繁殖快 (4)对其质粒DNA的分子生物学背景清楚 (5)表达调控研究比较全面,1、原核生物的基因转移,2、真核生物细胞的基因转移,要使外源基因在真核细胞内正确表达，首先要构建适当的表达系统，然后再转入细胞 方法： (1)磷酸钙沉淀法 (2)EDAE葡聚糖转染法 (3)电穿孔DNA转染法 (4)逆转录病毒载体转染法 (5)脂质体转化法,3、动物的转基因技术,逆转录病毒转导(Retrovirus-Mediation Transgenesis) 原核显微注射(Pronuclear Microinjections) 胚胎干细胞方法(Embryonic Stem Cell Method) 精子介导法(Sperm Mediated Transfer),（1）显微注射技术,是采用显微注射仪对受精卵进行注射，将外源DNA直接注射到受精卵的原核中。

最先由Gordon等人(1980)报道随后Brister(1981)，Hogan(1986)和Allen(1987)作了更详细的描述Pronuclear injection,显微注射技术优点,1.实现基因导入的速度快且操作简单，对DNA大小无限制（最大达250Kb） 2.由于是将基因直接导入原核中，很少产生嵌合体，有利于对当代基因表达的分析，并能快速地建立转基因品系显微注射技术缺点：,1.需要特殊的仪器，包括倒置显微镜和显微 操纵仪，拉针仪等还需要熟练的操作技术 2.由于DNA整合位点难以控制，而且整合拷贝数可从1~几百个，无法作人为的控制2）逆转录病毒载体技术,根据逆转录病毒cDNA能够。